嗅觉通路神经干细胞研究进展

黄 莉，樊建刚，韩 亮，冯 勇△

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.耳鼻咽喉头颈外科，b.科技部，四川 成都 610072)

嗅觉通路神经干细胞研究进展

黄 莉a，樊建刚a，韩 亮b，冯 勇a△

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.耳鼻咽喉头颈外科，b.科技部，四川 成都 610072)

干细胞是能自我更新增殖和分化的细胞，能够产生表现型与基因型和自身相同的子细胞，同时还能分化为祖细胞。神经干细胞指来自神经系统并可以经过自我更新或者不对称分裂，产生除自身以外的其它细胞，可向特定类型的神经元或星形胶质细胞和少突胶质细胞分化[1]。研究发现，从发育中甚至成年中枢神经系统组织中，可以分离出具有多潜能干细胞，并能在体外培养成永生的神经祖细胞系，这有望成为合适的体外转基因载体之一，为中枢神经系统先天性、创伤性和退行性疾病的治疗提供新策略。

神经干细胞；嗅上皮；嗅球；嗅感觉神经细胞

哺乳动物嗅通路中的嗅上皮和嗅球中也存在神经干细胞(neural stem cells，NSCs)，嗅上皮和嗅球NSCs的生物学特性已是神经科学研究的重点方向。本文对嗅上皮和嗅球NSCs的解剖生理来源及特性进行简要阐述，为研究嗅上皮和嗅球NSCs移植治疗中枢神经系统先天性、创伤性和退行性疾病奠定理论基础。

1 嗅上皮NSCs的来源

脊椎动物的嗅感觉神经细胞(olfactory receptor neuron，ORN)可终生再生，新生的ORN由NSCs分化而来。嗅上皮最顶端为支持细胞，其下方为ORN，NSCs分布在嗅上皮基底层。从形态学划分，成年小鼠嗅上皮NSCs分为球状基底细胞(global basal cells，GBCs)和水平状基底细胞(horizontal basal cells，HBCs)，其中HBCs紧贴在基底膜上，而GBCs位于HBCs上方。研究发现，通常ORN的再生由GBCs完成，外源性转化生长因子-B(TGF-B)及血小板衍化生长因子(PDGF)等可通过程序性调控诱导GBCs向神经元转化；只有在嗅上皮严重受损情况下，HBCs才活化增殖，并最终分化为嗅上皮的各种细胞成分[2]。

在基底细胞分裂慢速阶段，基底细胞分裂产生另一个位于基底膜附近的干细胞和一个神经前体细胞，这个神经前体细胞最后生成大量未成熟神经元，并在分化过程中从基底膜向嗅上皮表面移行[3]，伴随这一过程同时进行的是成熟嗅上皮中的神经细胞凋亡[4]。由此可见，哺乳动物嗅上皮处于基底细胞生成、神经细胞分化、基底细胞和神经细胞凋亡的动态平衡中，这种平衡可能是由自分泌和旁分泌信号参与调控，从而最终刺激或抑制增殖[5]。其中，神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子-3(NT-3)参与调节成熟ORN凋亡及增加前体细胞增殖；而生长和分化因子II (GDFII)抑制神经前体细胞转化为神经细胞[6]。

2 嗅上皮NSCs的培养

嗅上皮NSCs可通过自体取材获得，并能通过体外培养进行扩增。研究证实，采用无血清、非神经细胞培养方法可从嗅上皮分离培养出三种细胞，包括球形基底细胞、水平基底细胞及少量的支持细胞，并且体外培养的嗅上皮神经干细胞具有多向分化潜能。

在NSCs分离培养的研究中，酶消化法(如胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶等)和机械分离法都可以用来分离NSCs。高亮等[7]通过不同消化酶(如中性蛋白酶和I型胶原酶)分阶段酶解消化嗅上皮，可以原代富集到纯度较高的嗅上皮NSCs(呈集落状生长)，进行细胞扩增后，用含生长因子(bFGF)的无血清培养液促使传代细胞增殖形成神经球，通过血清诱导神经球分化，可维持嗅上皮NSCs的增殖活力和多潜能性，表现为从神经球迁移出的分化细胞具有很高异质性，高亮通过免疫细胞化学染色发现神经球细胞具有向神经元、星形胶质细胞和寡突胶前体细胞分化的潜能。目前，对于诱导嗅上皮NSCs向特定种类的细胞分化(如向多巴胺能神经元分化)所需的条件，仍有待于进一步研究。另外，有些理论认为，由于酶消化法可以部分破坏细胞存活所需的细胞表面粘附分子和细胞基质等成分，并且胰蛋白酶残留可能会影响细胞的生长，所以推崇采用机械分离法来制备单细胞悬液，这样能够提高分离的活细胞率，并且形成较多的细胞球。

Mumm等[8]采用无血清培养方法从胚胎小鼠嗅上皮培养出神经克隆形成细胞，并最终分化为神经元。研究发现，在培养过程中，必须有来自嗅上皮底层基质的细胞共培养，才能形成可分化为神经元的神经克隆，而与分化成熟的嗅上皮神经元共培养时，神经克隆形成数量明显减少，这表明嗅上皮底层基质中的细胞可能分泌促进神经克隆形成的某些因子，而分化成熟的神经元对神经克隆的形成有反馈抑制作用，这与前文研究发现一致[4]。Roisen等[9]用DMEM /F12 (1：1)和10%胎牛血清的培养液，从成人嗅上皮分离培养出可以形成神经球并具有自我更新能力，向神经元、胶质细胞多向分化潜能的NSCs。Othman等[10]采用神经球培养方法从硫酸锌刺激后的绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠嗅上皮中分离培养出nestin免疫反应阳性NSCs，可直接用于创伤性和退行性中枢神经疾病的NSCs移植治疗研究。

嗅觉系统中存在许多与内耳发生发展有关联的基因，如neurog1、neurod1及foxg1[11]。朱秋蓓等[12]通过体外原代及传代培养大鼠嗅上皮NSCs，获得具有多分化潜能的神经干细胞球，将嗅上皮NSCs与体外培养的毛细胞或耳蜗培养液共培养，诱导嗅上皮NSCs分化为耳蜗毛细胞。Doyle等[13]报道了嗅上皮神经前体细胞同耳蜗细胞共培养，或用耳蜗细胞的条件培养液诱导的方法，在体外诱导嗅上皮神经前体细胞分化形成耳蜗毛细胞，分化的细胞在形态上与毛细胞相似并表达多种毛细胞的标志分子，包括 myosinVIIa、FM1-43、calretinin、phal-loidin和espin，以上均为探索嗅上皮NSCs治疗毛细胞损伤所致的感音神经性耳聋提供了理论依据。Murrell等[14]则在不同培养条件中将成体嗅上皮NSCs定向诱导分化为肝细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞。

3 嗅球NSCs的来源

嗅球最外层为嗅神经层，由ORNs的轴突及鞘细胞组成。ORNs的轴突在嗅球内侧的小球层与二级神经元僧帽和簇状细胞的树突形成突触。小球层周围为由中间神经元组成的小球周围细胞。小球层的内侧是外丛层，由簇状细胞体及树突、僧帽细胞和颗粒细胞的树突组成，其内侧为僧帽细胞层。内丛层主要由僧帽细胞和簇状细胞的轴突、颗粒细胞的树突组成，其由侧为颗粒细胞层，包含颗粒细胞体及嗅球的第二型中间神经元。嗅球的中央是由吻侧迁移流(RMS)向前延伸的室管膜下层，内含由侧脑室的室下区(SVZ)产生的NSCs。室管膜下层中的生成嗅球中的中间神经元、颗粒细胞和小球周围细胞[15]。

啮齿动物出生后，颗粒细胞层中及小球层周围的中间神经元由来自SVZ，经RMS迁移到嗅球的NSCs生成。脑室周围区域产生的NSCs在未知因素作用下经RMS迁移至嗅球的室管膜下层，疏散进入嗅球的颗粒细胞层和小球周围区域并分化成为中间神经元[16]，即嗅球的颗粒细胞层和小球周围NSCs负责出生后嗅球的神经发生[17]。研究表明，嗅球自身也存在NSCs，且大部分分化为胶质细胞；而来自RMS的NSCs多数分化为神经元[18]。

4 嗅球NSCs的培养

嗅球内富含NSCs，取材简便，细胞获得率高，并且在体外培养时显示出向神经细胞及非神经细胞的多向分化潜能，是NSCs自体移植最理想的取材部位。Pagano等[19]首先采用无血清神经球悬浮培养方法从人嗅球成功分离培养出具有自我更新并能分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的NSCs。在无血清培养基中去除生长因子后，由于营养供给及细胞因子受体活性发生改变，使得嗅球NSCs由分裂增殖状态过渡到分化状态。另外发现，无血清诱导下，嗅球NSCS更多地分化为神经元，而有血清培养如胎牛血清，有助于嗅球NSCS更多的向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化，并且血清浓度与胶质细胞的分化程度成正比关系。研究还发现，嗅球NSCs增殖分化特性在不同发育阶段存在一定的差异：随着发育阶段的增长，形成神经球的细胞数量减少，神经元分化趋势逐渐减少。在个体发育不同阶段中，嗅球NSCs的生物学特性出现差异，导致嗅球NSCs增殖分化特性发育差异的机制和意义，应当是进一步研究的重点。

鉴于NSCs的培养与其它神经细胞不同，研究者为了维持其干细胞特点，需要特殊的培养条件来保证NSCs的分裂增殖并抑制细胞分化，所以NSCs的培养需要添加生长因子(如bFGF/EGF等)。郭向东等[20]采用神经细胞球形成法，以无血清培养液，使用生长因子(bFGF/EGF)进行大鼠嗅球NSCs体外扩增培养，以机械分离法连续传代，运用相差显微镜及电子显微镜观察细胞形态，通过免疫细胞化学法检测Nestin表达，运用四甲基偶氮哇盐(MTI)，比色法和流式细胞仪检测嗅球NSCs的增殖能力。研究证实[20]，NSCs在体内的发育依赖于多种生长因子(如IGF-I和BDNF)的作用。其中，IGF-I是一种促生长肽类激素(growth promoting peptide hormone)，有神经营养特性；BDNF是第2种被鉴定的神经营养素，主要在中枢神经系统表达[21]，是脑内分布最广的神经营养因子。IGF-I可以通过靶细胞表面的特异性受体来促进嗅球源性NSCs增殖和分化；而BDNF对嗅球源性NSCS的增殖分化不起主导作用，但BDNF可增强IGF-I的作用[22]。更多地认识细胞因子在嗅球NSCs增殖分化过程中的作用，将有助于我们深入了解嗅球NSCs增殖分化的分子生物学机制，提高我们控制嗅球NSCs向特定功能神经细胞定向分化的精确度，对将来NSCs移植治疗神经系统疾病意义重大。

5 NSCs应用

5.1细胞替代治疗指在将体外培养和扩增的NSCs移植到脑内，治疗因细胞死亡或凋亡引起的疾病，如帕金森氏病、Huntington病、神经性耳聋等[23]。目前，细胞替代实验的开展主要分为以下三个思路：①内源性NSCs的自身激活。然而，研究发现，中枢神经系统损伤导致内源性NSCs的增殖产生的几乎全是胶质细胞[24]，所以，内源性NSCs的自身激活有效率不高，而NSCs移植仍然是最可行的神经组织替代治疗策略；②异体NSCs移植。体外培养的NSCs移植到脑内后能够迁移分化为特定部位的神经细胞，这些分化后的神经细胞能很好地整合于宿主组织，与其它神经元建立突触联系，分泌神经递质并发挥功能。陈福权等[25]采用细胞培养、基因转染及细胞移植的方法，分别从从胚胎、新生及成年大鼠嗅球分离培养NSCs，将携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的新生大鼠嗅球NSCs移植至正常成年大鼠耳蜗，结果表明植入耳蜗的NSCs可存活数周，主要分化为星形胶质细胞，迁移至螺旋神经节及其周围突区域，可主动产生分泌GDNF及NGF。研究表明，NSCs可能替代缺失或损伤的螺旋神经节细胞，并对内耳毛细胞及螺旋神经节细胞有营养支持作用。庞飞等[26]制备大鼠下胸段脊髓打击损伤模型，将嗅粘膜来源神经干细胞(BMSCs)和骨髓间充质干细胞(OM-NSCs)联合移植，免疫荧光显示移植的BMSCs和OM-NSCs均能迁移至脊髓损伤区，并在损伤区存活。但是，关于异体NSCs移植治疗策略，有两点需要注意：①移植NSCs细胞的分化方向和功能是由其所处的微环境而不是NSCs自身内在特性决定；②分化效率偏低，如Vescovi等[27]在研究NSCs细胞移植治疗帕金森氏病时发现，在体外实验中没有必须的因素干预下，自然分化为多巴胺能神经元的比例只占细胞总数的0.5%～5%。因此，如何精确调控干细胞分化效率成为研究重点；③自体NSCs移植。Pagano等[28]首次将嗅球切除术患者的嗅球组织进行体外分离培养NSCs并获得成功，并建立了“嗅球干细胞系”，为NSCs自体移植的细胞来源提供了初步探索。

5.2基因/药物治疗载体鉴于很多有治疗作用的大分子物质如神经生长因子、脑源性生长因子等都不能通过血脑屏障，NSCs作为基因/药物治疗载体，具有迁徙能力，可以整合于宿主组织，能分化为成熟细胞修复病损组织并且可以避免免疫排斥反应的特点，为治疗一些CNS疾病开辟了新途径。动物实验表明[29]，通过转基因技术，将编码神经营养因子的基因片段导入NSCs中，移植到脑内后，NSCs能迁移并整合于病变部位，长时间表达如神经生长因子、白介素-4、活性酶和神经递质等外源基因产物，并不同程度改善动物疾病模型的症状或抑制肿瘤生长，延长动物生存时间。已有报道，用逆转录病毒介导的B-葡萄糖醛酸酶基因转染NSCs，再将其注入MPSVII新生鼠脑内，结果发现治疗组小鼠行为及神经功能均恢复正常，并且病理分析发现移植的细胞己经弥散到全脑[30]。

6 展望

嗅球和嗅上皮终生维持活跃的神经细胞更新，并且取材简便，是目前获取NSCs的重要模型，也是自体NSCs移植的可靠来源。目前，我们对于嗅觉通路NSCs生长特性、分化机制的了解仍不全面，需进一步探讨。

[1] Seaberg RM，van der Kooy.Adult rodent neurogenic regions：theventricular subependyma contains neural stem cells，but the dentategyrus contains restricted progenitors[J].Neurosci，2002，22：1784-1793.

[2] Leung C T，Coulombe P A，Reed R R.Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration[J].Nat Neurosci，2007，10：720-726.

[3] Mackay-Sim A，Kittel P.Cell dynamics in the adult mouse olfactory epithelium：a quantitative autoradiographic study[J].J Neurosci，1991，11(4)：979-984.

[4] MahalikT.Apparent apoptotic cell death in the olfactory epithelium of adult rodents death occurs at different developmental stages[J].J Comp Neurol，1996，372：457-464.

[5] Fung KM，Peringa J，Venkatachalam S，et al.Coordinate reduction in cell proliferation and cell death in mouse olfactory epithelium from birth to maturity[J].Brain Res，1997，761：347-351.

[6] Wu HH，Ivkovic S，Murray RC，et al.Autoregulation of neurogenesis By GDF[J].Neuron，2003，7：197-207.

[7] 高亮，曹莉，苏志达，等.体外培养的嗅上皮神经干细胞具有多潜能性[J].Academic Journal of Second Military Medical University，2009，9 ：985-989.

[8] Mumm JS，Shou J，Calof AL.Colony-forming progenitors from mouse olfactory epithelium：evidence for feedback regulation of neuron production[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：11167-11172.

[9] Roisen FJ，klueber KM，Lu CL，et al.Adult human olfactory stem cells[J].Brain Res，2001，890：11-22.

[10]Othmanmm，Klueber KM，Roisen FJ.Identification and culture of olfactory neural progenitors from GFP mice[J].Biotech Histochem，2003，78：57-70.

[11]Beites CL，Kawauchi S，Crocker C，et al.Identification and molecular regulation of neural stem cells in the olfactory epithelium[J].Exp Cell Res，2005，306：309-316.

[12]朱秋蓓，徐亚平，范静平等.嗅上皮神经干细胞在内耳干细胞移植中的应用现状[J].J Clin Otorhinolaryngol Head Neck Surg(China)，2011，13：621-623.

[13]Doyle KL，Kazda A，Hort Y，et al.Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells[J].Cell，2010，141：704-716.

[14]Murrell W，Feron F，Wetzig A，et al.Multipotent stem cell in adult olfactory mucosa[J].Dev Dynamics，2005，233：496-515.

[15]Murray RC，Calof AL.Neuronal regeneration：Lessons from the olfactory system[J].Semin Cell Dev Biol，1999，10：421-431.

[16]Zigova T，Betarbet R，Soteres B，etal.A comparison of the pattern of migration and destinations of homotopically transplanted neonatal subventricular zone cells and heterotopically transplanted telencephalic ventricula rzone cells[J].Dev Biol，1996，173：459-474.

[17]Luskin MB，Zigova T，Soteres BJ，et al.Neuronal progenitor cells derived from the anterior subventricular zone of the neonatal rat forebra in continue to proliferat in vitro and express a neuronal phenotype[J].Mol Cell Neurosci，1997，8：351-366.

[18]Fukushima N，Yokouchi K，Kawagishi K，et al.Differential neurogenesis and gliogenesis by local and migrating neural stem cells in the olfactory bulb[J].Neurosci Res，2002，44：467-473.

[19]Pagano SF，Impagnatiello F，Girelli M，et al.Isolation and characterization of neural stem cells from the adult human olfactory bulb[J].Stem Cells，2000，18(4)：295-300.

[20]郭向东，叶放蕾，娄卫华，等.大鼠嗅球神经干细胞增殖及诱导分化的实验研究[D].郑州大学，2006.

[21]Tropepe V，Sibilia M，Ciruna BG，et al.Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon[J].Dev Biol，1999，208(1)：166-188.

[22]Takahashi J，Palmer TD，Gage FH.Retinoic acid and neurotrophins collaborate to regulate neurogenesis in adult-derived neural stem cell cultures[J].J Neurobiol，1999，38：65-81.

[23]Long JE，Garel S，Depew MJ，et al.DLX5 regulates development of peripheral and central components of the olfactory system[J].J Neurosci，2003，23(2)：568-578.

[24]Modo M，Rezaie P，Heuschling P，et al.Transplantation of neural stem cells in a rat model of stroke ：assessment of short-term graft survival and acute host immunological response[J].Brain Res，2002，958(1)：70-82.

[25]陈福权，王锦玲，等.大鼠嗅通路神经干细胞培养及耳蜗移植[D].第四军医大学，2005.

[26]庞飞，严世贵，等.骨髓间充质干细胞体外联合嗅粘膜来源神经干细胞移植治巧大鼠脊髓损伤[D].浙江大学，2015.

[27]Shihabuddin LS，Horner PJ，Ray J，et al.Adult spinal cord stem cells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus[J].J Neurosci，2000，20(23)：8727-8735.

[28]Johansson CB，Svensson M，Wallstedt L，et al.Neural stem cells in the adult human brain[J].Exp Cell Res，1999，253(2)：733-736.

[29]Dunn IF，Black PM.The neurosurgeon as local oncologist ：cellular and molecular neurosurgery in malignant glioma therapy[J].Neurosurgery，2003，52(6)：1411-1422.

[30]Snyder EY，Taylor RM，Wolfe JH.Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MPS VII mouse brain[J].Nature，1995，374(6520)：367-370.

Research progress on the olfactoryneural stem cells

HUANG Li，FAN Jian-gang，HAN Liang，FENG Yong

四川省科技厅科技支撑计划项目(编号：2014SZ0051)

R329

B

1672-6170(2017)05-0249-04

2017-04-13；

2017-05-26)

△通讯作者