高效液相色谱法测定婴幼儿配方羊奶粉中酪蛋白磷酸肽含量

高效液相色谱法测定婴幼儿配方羊奶粉中酪蛋白磷酸肽含量

文/李则均

（黑龙江完达山乳品有限公司）

采用高效液相色谱法测定婴幼儿配方羊奶粉中酪蛋白磷酸肽（CPPs）含量。样品前处理采用超声提取，盐酸调节pH值4.4～4.6沉淀酪蛋白。流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈梯度洗脱。试验结果表明，在波长254 nm条件下，目标物CPPs保留时间为24.408 min。试验使用检出范围为30～300 μg/mL，在此范围内CPPs呈良好的线性，线性回归方程y=375.82x+7385.4，R2＞0.9997。加标回收率在96.8%～107.3%。试验的计算标准偏差为3.3，相对偏差为0.49%。

酪蛋白磷酸肽（CPPs）；紫外高效液相色谱法；婴幼儿配方羊奶粉

酪蛋白磷酸肽简称CPPs，是用胰酶或胰蛋白酶水解的酪蛋白，其核心结构为丝氨酸、谷氨酸、磷酸基。CPPs在中性和弱碱性环境下能与钙结合，避免钙的流失，促进钙的吸收。CPPs对钙促吸收的作用主要表现在促进小肠对钙的吸收利用，促进牙齿、骨骼发育。CPPs还对铁、锌有很好的吸收利用效果。CPPs是从天然蛋白质中提取的多肽，具有不良反应小、安全可靠、致敏率低等特点。婴幼儿配方羊奶粉营养成分更接近人乳，更易被人体吸收，因此近年来婴幼儿配方羊奶粉拥有广阔市场。综上所述，在婴幼儿配方羊奶粉中添加CPPs有很广泛的前景。

CPPs的测定方法一般采用LC-MS或者毛细管区带电泳法。前者检测成本高，不适用于企业批量生产的婴幼儿配方羊奶粉中CPPs的测定。后者操作复杂，婴幼儿配方羊奶粉含有强化钙、铁、锌等金属盐类成分，CPPs与这些盐类成分相干扰，很难测定。本文采用高效液相色谱法，尝试建立一种高效更适用于婴幼儿配方羊奶粉中CPPs的含量测定方法。

1 材料方法

1．1 仪器与标准品

1．1．1 仪器

高效液相色谱：PE紫外检测器。

表1 梯度洗脱条件

数控超声波清洗器：K Q-1000DB，昆山市超声仪器有限公司。

pH计：METTLER TOLEDO生产MP220。

1．1．2 标准品

CPPs：AflaTest LEVELOPER生产。

1．2 试剂

超纯水：Millipore纯水机制备；甲酸：CNW生产，色谱纯，浓度0.1%；乙腈：DiKMA生产，色谱纯；盐酸：浓度1 mol/L。

1．3 预处理方法

称取CPPs的婴幼儿配方羊奶粉5.0 g于100 mL烧杯中，用40～50℃30 mL超纯水溶解。样品超声10 min，超声温度40 ℃。用1.0 mol/L盐酸调节溶液酸度pH值4.5±0.1，溶液定容置于50 mL容量瓶。滤液过0.45 μm滤膜，待用。

2 分离条件

2．1 色谱柱

Agilent Eclipse生产的SBC18，5 μm，4.6×250 mm。

2．2 流动相

A：0.1%甲酸；B：乙腈。梯度洗脱，洗脱条件见表1。

2．3 进样量

100 μL。

2．4 检测波长

254 nm。

3 结果与分析

3．1 婴幼儿配方羊奶粉中CPPs目标峰的确定

采用相同前处理方法分别对CPPs标准品、不含CPPs的空白羊奶粉以及CPPs添加量为300 mg/100 g的羊奶粉进行测定，色谱图见图1～图3。通过图1分析，CPPs目标峰保留时间初步确定为24.40 min，在该保留时间内易排除前段梯度洗脱物干扰，又具有很好的响应强度，与其它峰得到较好的分离。经过空白对比试验，表明在CPPs保留时间内没有检测到干扰峰，又验证了此方法的有效性（图2）。因此可以根据图3确定CPPs目标峰的保留时间24.408 min。

用该方法对添加CPPs的完达山牌婴幼儿配方羊奶粉，进行了4 批不同生产批次检测，得到色谱图图4～7。通过对色谱图分析得出，该检测指标在不同批次CPPs产品谱图有很好的重现性，其可作为幼儿配方羊奶粉中CPPs的监测指标。

图1 CPPs标准品图谱

图2 不含CPPs的空白奶粉图谱

图3 添加CPPs婴幼儿配方羊奶粉图谱

图4 添加CPPs 1批次婴幼儿配方羊奶粉图谱

图5 添加CPPs 2批次婴幼儿配方羊奶粉图谱

图6 添加CPPs 3批次婴幼儿配方羊奶粉图谱

图7 添加CPPs 4批次婴幼儿配方羊奶粉图谱

表2 CPPs标准溶液浓度与对应峰面积

3．2 标准曲线与检出限

试验的使用检出范围为30～300 μg/mL，线性回归方程y=375.82x+7 385.4，R2＞0.9997，见表2和图8。

标准曲线最低点浓度为3 0 μg/mL，一般幼儿配方奶粉中添加CPPs含量为奶粉中钙含量的0.3～0.5 倍，大部分钙强化剂钙含量都大于1%，即CPPs含量大于0.3%，因此检出限为30 μg/mL能满足检测要求。

3．3 精密度

根据标准偏差计算公式计算标准偏差为3.3，符合要求，在重复条件下获得5 次独立试验结果的绝对差值与算数平均值的比值为0.49%，符合要求（＜5%），结果见表3。

图8 CPPs标准曲线

3．4 回收率

回收率试验选取没有添加过CPPs的奶粉作空白，分别添加检出限浓度30 μg/mL 、标准曲线0.3浓度100 μg/mL和标准曲线0.7浓度250 μg/mL进行试验，测得回收率见表4。总回收率为100.5%，30 μg/mL的回收率较高为105.7%，100 μg/mL的回收率为98.2%，250 μg/mL的回收率为97.6%。浓度在标准曲线中间部分的回收率较稳定。

表3 精密度试验结果

表4 回收率试验

4 讨论

4．1 本文采用的测定婴幼儿配方羊奶粉中CPPs含量的方法，前处理简单，稳定性好，回收率高，适合企业批量生产婴幼儿配方羊奶粉中CPPs的检验。羊奶粉中蛋白成分复杂，干扰因素多，本方法通过梯度洗脱，较好的分离了CPPs，因此本方法还可以用于其它食品中CPPs的测定。

4．2 在前处理阶段，用较热的纯水溶解样品有利于提高CPPs测定含量。梯度洗脱对于机器平衡要求很高，一般以初始流动相比例最好平衡2 h以上，再进行样品的测定。由于夏季温度和冬季温度差异较大，在洗脱阶段适当调节B流动相比例。

4．3 本文前处理采用等电点沉淀蛋白去除干扰成分，操作简单，采用高效液相色谱法测定CPPs含量定量准确，适合批量检测。C

[1] Al-HajO A，Al-KanhalH A． Compositional，technological and nutritional aspects of dromedary camel milk[J]． International Dairy Journal，2011，20（12）：811-821．

[2] 张帅，刘飞，罗珍，等． 高效液相色谱法测定钙片中酪蛋白磷酸肽的含量[J]． 现代食品科技， 2014（7）：258-262．

[3] 刘玉娟． 高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中酪蛋白磷酸肽的含量[J]． 乳业科学与技术，2016，39（4）：26-28

[4] 李想，刘小力．酪蛋白磷酸肽（CPPs）生理功能及市场应用[J]． 中国食品工业，2010（3）：51-52．

[5] 王玉莹，陈锡威，冯凤琴，等． 酪蛋白磷酸肽的研究进展[J]． 食品工业，2014（5）：204-208．

Determination of the Content of Casein Phosphopeptides（CPPs）in Infant Formula Using High Performance Liquid Chromatography

LI Ze-jun
（Heilongjiang Wondersun Dairy Co. Ltd.）

High performance liquid chromatography was used to determine the content of CPPs in infant formula. The samples were pretreated by ultrasonic extraction，and pH was adjusted to 4.4～4.6 by hydrochloric acid to precipitate casein. The mobile phase was eluted with a gradient of 0.1% formic acid in water and acetonitrile. The experimental results showed that the retention time of CPPs was 24.408 min at 254nm. The linear range was 30～300 μg/mL，and the linear regression equation was y=375.82x+7385.4，R2>0.9997. The recoveries ranged 96.8%~107.3%. The calculated standard deviation was 3.3 and the relative deviation was 0.49%.

casein phosphopeptides（CPPs）；UV - high performance liquid chromatography；infant formula sheep powder

李则均（1983-），女，工程师，主要从事质量分析工作。

2016-10-13）