HIV感染和非HIV感染人群抗耶氏肺孢子菌主要表面糖蛋白的IgG和IgM抗体水平调查

郭爽 刘意 田小军 栗绍刚 宋营改 任翊

(1.首都医科大学附属北京友谊医院 北京热带医学研究所 热带病防治研究北京市重点实验室，北京 100050；2.首都医科大学附属北京佑安医院检验科，北京 100069；3.北京大学第一医院皮肤性病科，北京 100034)

耶氏肺孢子菌 (Pneumocystisjirovecii，Pj)是一种具有宿主种属特异性、唯一感染人类、在人群中普遍存在的真菌[1]，人类出生后即开始接触Pj并产生特异性免疫反应，出生几个月后获得的Pj感染往往是无症状的自限性感染[2-3]，免疫力正常的个体随时清除从人群中暴露获得的Pj而不发病，但当宿主免疫力低下时，随时暴露的Pj可以导致致死性的肺孢子菌肺炎 (Pneumocystis pneumonia，PCP)，因而Pj是HIV感染、器官移植、造血干细胞移植、免疫抑制药物治疗[4]和肿瘤放化疗免疫治疗后[5]患者重要的机会性感染病原体。主要表面糖蛋白 (Major surface glycoprotein，Msg)是Pj表达量最大的分泌蛋白，Msg在Pj细胞壁表面形成一层蛋白层，并通过有性繁殖中的抗原转换机制，不断在子代个体中使用不同的Msg，以逃避宿主免疫清除[6-7]。HIV感染人群中，抗Pj Msg抗体水平分布情况资料甚少，本研究通过合成Pj Msg人工抗原，建立酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，调查HIV组和非HIV组抗Pj Msg IgG和IgM抗体定量水平情况。

1 材料和方法

1.1 材料

主要试剂 PrimeSTAR HS DNA聚合酶 (TaKaRa)，T4 DNA连接酶 (TaKaRa)，限制性核酸内切酶SmaI和EcoRI (Fermentas)，蛋白Pageruler (Thermo),谷胱甘肽Sepharose亲和柱 (Novagen)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体 (北京中杉金桥)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgM抗体和辣根过氧化物酶底物 (上海生工生物)，其他试剂均为国产分析纯。

菌株与质粒 克隆PCR产物的T载体 (北京碧橙蓝生物)，表达载体pGEX-3X (Amersham Pharmacia Biotech)，大肠杆菌Top10F' (北京全式金生物)。PCR引物合成及测序均由上海生工生物工程有限公司完成。

标本来源 人群血清：2013年9月4日～10月23日北京市友谊医院非HIV人群血清样本266例。年龄分布在20～50之间，其中男性患者134例，平均年龄35.64±8.04岁，女性患者132例，平均年龄33.97±8.82岁。2014年4月20日～5月20日北京市佑安医院HIV感染者血清样本176例，其中男性患者170例，平均年龄34.93±9.60岁，女性患者6例，平均年龄35.00±8.53岁。HIV感染组为规律使用抗逆转录病毒治疗患者，其中123名患者外周血CD4+T淋巴细胞≥350/μL，53名患者外周血CD4+T淋巴细胞<350/μL (30.1%)。入选人群均根据PCP诊断标准排除了PCP诊断[8]。血清样本的使用均经过北京友谊医院和北京佑安医院伦理审查委员会批准，HIV阳性血清处理在北京佑安医院艾滋病实验室进行。

1.2 方法

PCR扩增Pj Msg基因片段 从确诊PCP患者的痰中提取DNA作为PCR模板，采用自行设计的引物Pj Msg1和Pj Msg2 (由上海生工生物工程有限公司合成)进行PCR扩增。Pj Msg1：5′-YGGGCGGTTAAGCGG；Pj Msg2：5′-TGCTTCCTCCAAAAATAGGCA。PCR反应体积 (50μL)：5×PCR缓冲液10 μL，dNTP 4 μL，引物2 μL，模板DNA 1 μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 32.5 μL。PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环。

重组Pj Msg抗原的表达 将目的片段为348 bp的Msg基因转入原核表达载体pGEX-3X，经谷胱甘肽亲和层析柱纯化，获得可溶Pj Msg重组蛋白[9]。

抗Pj Msg IgG和IgM抗体相对定量水平的ELISA检测方法 将纯化后的Pj Msg抗原按100 μg/cm2的量滴在硝酸纤维 (Nitrocellulose，NC)膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后用PBS清洗膜，将抗原标记的NC膜放入非HIV组20例随机血清中，作用1 h后取出NC膜丢弃，按上述方法重复1次，使血清中可能存在的抗Pj Msg抗体完全吸附掉，人为制备出阴性标准血清。将阴性标准血清按1∶100稀释进行ELISA检测。稀释液为PBS液，含有5%脱脂奶粉和5% (v/v)pGEX-3X 质粒转化大肠杆菌Rosetta在同样条件下诱导后获得的可溶蛋白。Pj Msg抗原酶标板包被量为0.2 μg/孔，设空白对照，TMB显色10 min，2 mol/L H2SO4终止后用酶标仪 (Synergy H1)检测，用450 nm/630 nm双波长检测。样本OD值=样本 (OD450-OD630)-[空白 (OD450-OD630)]。计算20例阴性标准血清的OD值分布情况以确定阈值，并把阴性标准血清混合分装，作为阴性对照统一使用。并将预实验中OD值最高的15例非HIV血清混合分装作为阳性对照统一使用。

进行相对定量检测的样本血清，用阴性标准血清以1∶2、1∶4和1∶8的比例稀释，将原血清和稀释后的血清1∶100的比例上样，用上述ELISA方法检测，每板均设空白对照、阴性对照和阳性对照，当阴性对照OD值小于阈值，阳性对照OD值大于阈值时，认为本次试验有效，将产生阳性结果的最高稀释倍数定为样本血清的抗体滴度，最低滴度为1∶100，最高滴度为1∶800。辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体工作浓度1∶10 000，辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgM抗体工作浓度1∶10 000。

1.3 统计学方法

数据分析使用的SPSS 19.0，计数资料使用Pearson的卡方检验或Fisher精确检验，计量资料使用t检验。P值<0.01认为差异有统计学显著性意义。

2 结 果

20例阴性标准血清OD值分布为非正态分布，人为定义阴性标准血清OD值的95百分位数 (Percentile 95，P95)×2.1为阈值，样本检测抗Pj Msg IgG抗体时OD值>0.041定义为阳性；样本检测抗Pj Msg IgM抗体时OD值>0.063定义为阳性。非HIV组中抗Pj Msg IgG和IgM抗体的阳性率分别为42.5% (113/266)和41.7% (111/266)，HIV组中抗Pj Msg IgG和IgM抗体的阳性率分别为24.4% (43/176) 和12.5% (22/176)。针对阳性检出的样本进行抗体水平定量检测。

113例非HIV组样本抗Pj Msg IgG抗体在1∶100，1∶200，1∶400和1∶800滴度水平的检出率分别为68.1% (77/113)，13.3% (15/113)，5.3% (6/113)和13.3% (15/113)；几何平均滴度为1∶220。43例HIV组样本抗Pj Msg IgG抗体在1∶100，1∶200，1∶400和1∶800滴度水平的检出率分别为65.1% (28/43)，23.3% (10/43)，7.0% ((3/43)，和4.7% (2/43)，与非HIV组比较差异无统计学显著性意义 (χ2=4.254，P=0.235)；几何平均滴度为1∶202，与非HIV组比较差异无统计学显著性意义 (t=-0.694，P=0.489)。

111例非HIV组样本抗Pj Msg IgM抗体在1∶100，1∶200，1∶400和1∶800滴度水平的检出率分别为51.4% (57/111)，18.9% (21/111)，17.1% (19/111)和12.6% (14/111)；几何平均滴度为1∶266。22例HIV组样本抗Pj Msg IgM抗体在1∶100，1∶200，1∶400和1∶800滴度水平的检出率分别为45.5% (10/22)，9.1% (2/22)，18.2% (4/22)和27.3% (6/22)，与非HIV组比较差异无统计学显著性意义 (χ2=3.788，P=0.285)；几何平均滴度为1∶342，与非HIV组比较差异无统计学显著性意义 (t=1.213，P=0.236)。非HIV组和HIV组抗Pj Msg IgG和IgM抗体滴度分布情况见图1。

3 讨 论

Pj作为人群普遍感染的条件致病病原体，区分携带与致病十分重要。抗体变化是感染性疾病诊断中常用的病原学指标，但Pj人群抗体检出率高，用抗体检出与否无法辅助诊断PCP，抗体定量水平在PCP发病前后如何变化资料不多，因此抗体定量用于PCP诊断还缺少证据。Msg是重点研究的Pj与宿主相互作用的抗原，由于Pj有82～158个Msg基因储备[10]，每个Pj个体可以使用Msg基因储备中的一种，所以一个患者肺部Pj个体数量越多，Msg抗原复杂程度越大，此外Pj Msg还进化出地区差异[11]，因此不同的Msg靶基因片段选择、不同的原核或真核抗原[12]表达方式，抗体检测的阳性率和抗体定量水平都不尽相同，这给抗体辅助诊断带来了困难，但是随着方法学的标准化，越来越多的抗体定量用于临床。

图1非HIV组和HIV组抗Pj Msg IgG和IgM抗体阳性样本在1∶100，1∶200，1∶400和1∶800滴度水平的分布情况

Fig.1Distributions of anti-Pj Msg IgG and IgM positive samples in the titer levels of 1∶100,1∶200,1∶400,and 1∶800 in non-HIV group and HIV group

PCP常发生于免疫缺陷的患者，但免疫缺陷并不等于体液免疫没有反应，虽然HIV组抗Pj Msg IgG和IgM抗体检出率小于健康对照，但是检出阳性的样本抗体滴度水平不低于健康对照 (IgG 1∶202 vs.1∶220；IgM 1∶342 vs.1∶266)，说明HIV感染者针对Pj暴露能产生足够水平的抗体，推测可能免疫反应速度赶不上Pj Msg抗原转换速度时才导致PCP发病。基础研究表明Pj Msg变化复杂，但在氨基端和羧基端有若干保守区可以利用，本研究利用了一段Msg氨基端保守区进行表达，人群抗体检出率与国外的报道基本一致，Daly KR等[13]报道的HIV感染组和健康对照组抗Pj IgG抗体阳性率分别为27% (25/94)和40% (38/95)，本研究中为24.4% (43/176)和42.5% (113/266)。国外观察当PCP发生后宿主抗Pj Msg或KEX1 (Kexin protein)IgG抗体会比PCP前明显上升[14]，而且PCP恢复后抗Pj IgG抗体高水平状态还可以持续数个月[15]，HIV-1感染者在经历PCP后抗Pj Msg IgG抗体水平可以高于[16]或等同于[17]健康人群，本研究中HIV感染者在非PCP状态时，抗Pj Msg IgG和IgM抗体水平等同于健康对照，PCP发病后如何变化需要进一步研究。

抗体滴度检测方法是国际公认的一种观察抗体动态变化的手段，它利用人为制作的阴性标准血清对样本进行等比例稀释，观察抗体被判断为阳性时的稀释倍数，虽然判定阳性的阈值有人为定义的因素存在，但是只要保持判定标准不变和实验条件稳定，滴度检测能够反映抗体的动态变化情况。在本实验中，非PCP人群无论HIV组还是非HIV组，抗Pj Msg IgG抗体滴度水平大部分分布在1∶100和1∶200区间，进一步实验可以动态观察HIV人群PCP发病后的抗体水平，探讨抗体滴度变化辅助诊断PCP的可能。

在非PCP人群中，抗Pj Msg IgG抗体主要分布于1∶100和1∶200低滴度水平，抗Pj Msg抗体水平的定量检测方法及其临床意义值得进一步研究。

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