临床分离黏质沙雷菌的耐药性及对亚胺培南耐药机制

郭 普， 乔 艳， 张海涛， 李 竟

·论著·

临床分离黏质沙雷菌的耐药性及对亚胺培南耐药机制

郭 普， 乔 艳*， 张海涛， 李 竟

目的了解黏质沙雷菌耐药性及对亚胺培南耐药机制。方法收集安徽省蚌埠医学院第一附属医院2013年1月－2014年12月临床分离的152株黏质沙雷菌，纸片扩散法和仪器法测定菌株对抗菌药物的耐药性。对筛选出的亚胺培南耐药黏质沙雷菌，采用改良Hodge试验和EDTA协同试验进行碳青霉烯酶表型检测，琼脂稀释法检测加入外排泵抑制剂MC207110前后亚胺培南MIC值的变化。聚合酶链反应（PCR）检测碳青霉烯酶、AmpC酶及外膜蛋白基因的携带情况。结果152株黏质沙雷菌中87株对亚胺培南耐药，亚胺培南耐药菌株中12株改良Hodge试验阳性，9株EDTA协同试验阳性。46株加入外排泵抑制剂MC207110后亚胺培南MIC降低为原来的1/4～1/64；检出KPC耐药基因5株，IMP耐药基因8株，DHA耐药基因6株，外膜蛋白缺失16株。结论该院临床分离的黏质沙雷菌耐药情况严重，主要耐药基因型为KPC、IMP和DHA型。外膜蛋白缺失以及外排泵可能也是介导耐药的主要原因。

黏质沙雷菌； 亚胺培南； 耐药

黏质沙雷菌（Serratia marcescens）属肠杆菌科，在自然界分布广泛，已成为医院感染重要的条件致病菌[1]。碳青霉烯类是一类广谱、快速杀菌的β内酰胺类抗生素（包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等），是目前治疗产酶的肠杆菌重症感染最有效的药物之一。但近年来对该类药物耐药的肠杆菌检出率有上升的趋势，使临床抗感染治疗面临严峻的挑战，引起了临床的高度关注[2]。为了解蚌埠医学院第一附属医院黏质沙雷菌对碳青霉烯类抗生素的耐药情况，本研究对我院临床分离的黏质沙雷菌耐药性及亚胺培南耐药基因进行检测分析。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2013年1月－2014年12月我院临床分离的黏质沙雷菌152株（去除重复菌株），其中来自痰标本129株（84.9%）、创面分泌物18株（11.8%）、尿液3株（2.0%）、血液2株（1.3%）。标本的采集、送检、处理依据第三版《全国临床检验操作规程》。

1.1.2 仪器与试剂 全自动细菌鉴定药敏系统（法国梅里埃公司）；PCR仪（德国Biomera公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）。外排泵抑制剂MC207110（美国Sigma公司）；亚胺培南（杭州默沙东制药有限公司）。

1.1.3 质控菌株 大肠埃希菌 ATCC25922购自国家卫生计生委临床检验中心。阳性对照的产酶菌株由安徽医科大学第一附属医院沈继录博士惠赠。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定和药敏试验 细菌鉴定和药敏试验采用VITEK 2-compact全自动细菌鉴定药敏分析仪或纸片扩散法，药敏卡片使用GN13。采用2014版CLSI标准进行药敏结果判断。

1.2.2 碳青霉烯酶表型检测

1.2.2.1 改良Hodge试验 参照 CLSI 2014版方法，配制0.5麦氏浊度单位大肠埃希菌ATCC25922菌液，再用生理盐水1∶10稀释，用无菌棉签均匀涂布MH平皿。在平皿中间贴厄他培南（10 μg）纸片，用无菌接种环取少量待检菌，自纸片外缘向平皿边缘划线。待平皿干燥后放35 ℃孵箱，16～20 h培养。以产KPC阳性菌作对照，抗菌药物抑菌圈内出现矢状生长者为产碳青霉烯酶菌株。

1.2.2.2 EDTA协同试验 将待测菌株转至血平皿孵育过夜，挑取单个生长的菌落配制浓度为0.5麦氏单位的菌液，用无菌拭子将菌液均匀涂抹在MH琼脂平皿上，在平皿中间相距约5 cm处贴加2张亚胺培南纸片，并用加样枪在其中1张上滴加已配制好的0.5 mol/L的EDTA 4 μL，孵育过夜，以2张纸片抑菌圈大小相差7 mm以上为产酶菌株。

1.2.2.3 外排泵机制检测 在采用琼脂稀释法测定亚胺培南单药MIC的同时另设一组加入外排泵抑制剂MC207110（终浓度为20 mg/L）的亚胺培南的试验组。亚胺培南的浓度范围为128～0.06 mg/L。外排泵表型检测结果的判断以添加和不添加MC207110时MIC值降低为原来的1/4或更低者可推断认为该菌耐药性有外排泵机制参与。

1.2.3 PCR扩增和序列分析

1.2.3.1 试验引物 本试验中所使用的引物参照参考文献，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物相关信息见表1[3-5]。

1.2.3.2 PCR扩增 PCR反应体积为50 μL，反应体系：EX Taq酶0.5 μL、10×PCR buffer （Mg2+plus） 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、模板DNA 3 μL、引物F（10 μmol/L） 1 μL、 引 物R（10 μmol/L） 1 μL、H2O 35.5 μL。循环参数：94 ℃预变性5 min、94 ℃解链30 s、退火（温度见表1）30 s、72 ℃延伸60 s、30个循环、72 ℃延伸10 min、4 ℃保温停止。将扩增产物进行凝胶电泳、成像及结果分析，同时设空白为阴性对照，产酶株为阳性对照。

2 结果

2.1 菌株来源和科室分布

152株黏质沙雷菌主要来自呼吸道标本，占84.9%。该菌在ICU占比率最高，其次为老年病科，分别为32.9%和19.1%，其在不同科室分布见表2。

2.2 黏质沙雷菌的药敏分析

152株黏质沙雷菌对14种抗菌药物存在不同程度耐药，对头孢唑林、氨苄西林、氨曲南和头孢曲松耐药率较高，分别为100%、90.8%、90.8%和82.2%；对亚胺培南耐药率为57.2%，对阿米卡星较为敏感，耐药率为34.2%。见表3。

2.3 黏质沙雷菌耐药表型及基因检测结果

87株对亚胺培南耐药菌株中12株改良Hodge试验阳性，9株EDTA协同试验阳性。检出耐药基因KPC 5株，IMP 8株，DHA 6株，外膜蛋白缺失16株，未检出其他耐药基因，耐药基因检测结果见表4。部分菌株PCR扩增结果见图1。

2.4 黏质沙雷菌主动外排泵筛选检测结果

87株对亚胺培南耐药菌株中46株加入MC207110前后亚胺培南的MIC值由32～128 mg/ L降低至2～16 mg/L。

表1 各基因型片段引物序列、退火温度及产物长度Table 1 The primer sequences， annealing temperature used in this study and the expected product size

表2 152株黏质沙雷菌临床科室分布Table 2 Source of 152 Serratia marcescens strains by clinical department

3 讨论

黏质沙雷菌属肠杆菌科，是医院感染重要的条件致病菌，在患者机体免疫力低下时常引起尿路感染、呼吸道感染、血流感染和全身性感染等[6]。黏质沙雷菌对多种抗菌药物存在不同程度的耐药，特别是碳青霉烯类抗生素耐药菌株多为多重耐药菌株，其耐药机制复杂[5]。因此，研究黏质沙雷菌的耐药机制，指导临床合理用药，减少耐药发生成为迫切需要解决的问题。

表3 152株黏质沙雷菌对14种抗菌药物耐药率和敏感率Table 3 Susceptibility of 152 strains of Serratia marcescens to 14 antimicrobial agent（%）

2013－2014年，我院共分离出152株黏质沙雷菌，主要分离自ICU、老年病科及外科等科室的患者；主要来源于痰和创面分泌物标本。ICU、老年病科患者往往基础病严重，免疫力低下，住院时间长，使用呼吸机等侵袭性操作，长期大剂量抗生素的使用等因素易引起感染[7]。外科手术也增加了感染的机会。152株黏质沙雷菌对多数常用抗菌药物耐药率较高，对氨苄西林、头孢唑林、头孢曲松等β内酰胺类、氟喹诺酮类抗菌药物耐药率都高于60%。对碳青霉烯类抗生素亚胺培南的耐药率也高达57.2%，显著高于2014年CHINET细菌耐药监测结果6.7%[8]和全国细菌耐药监测网Mohnarin 2011－2012年细菌耐药监测结果6.7%[9]。

表4 87株亚胺培南耐药黏质沙雷菌耐药基因阳性率Table 4 The resistance genes identifed in 87 strains of imipenem-resistant Serratia marcescens

图1 OprD2基因型PCR检测结果Figure 1 PCR analysis of OprD2 gene

对碳青霉烯类抗生素的主要耐药机制是产水解碳青霉烯类抗生素的β内酰胺酶（碳青霉烯酶）。碳青霉烯酶可分为两大类，一类为活性中心含有丝氨酸的酶包括A组NmcA、Smel～3、KPC-1～4、GES-2和D组OXA家族的OXA-23～27、40、48等；另一类为金属酶IMP家族、GIM-1、VIM家族、SPM-1、SIM等酶[10-12]。本研究中87株耐亚胺培南黏质沙雷菌12株改良Hodge试验阳性，9株EDTA协同试验阳性。进一步进行碳青霉烯酶耐药基因检测发现，检出5株携带KPC基因，8株菌检出IMP基因，与相关报道不一致。孙瑶等[13]报道，黏质沙雷菌碳青霉烯类抗生素耐药机制主要是产碳青霉烯酶KPC-2、EBC。谢在海等[5]报道的耐药基因型主要是KPC和MOX。这可能与各地区抗生素选择性压力及耐药性的传播不同有关。相关报道显示高产染色体介导的AmpC酶和孔蛋白丢失引起通透性下降的协同作用也可引起碳青霉稀类抗生素耐药[14]，本组87株耐亚胺培南的黏质沙雷菌中介导AmpC酶的DHA基因检出6株，16株检出有外膜蛋白缺失，其中DHA基因阳性的菌株中5株伴有外膜蛋白缺失，提示AmpC酶产生合并外膜蛋白缺失也是导致该组菌亚胺培南耐药的原因之一。另外，相关报道AcrAB、SdeXY、SmdAB、SmfY等外排泵系统的高表达也是引起黏质沙雷菌耐碳青霉烯类抗生素的重要耐药机制[15]。对本研究中87株耐亚胺培南的黏质沙雷菌用MC207110进行外排泵筛选试验，结果有46株菌亚胺培南的MIC降低为原来的1/4～1/64，提示外排泵的高表达可能是介导本组菌耐药的又一重要原因，有待于近一步用RT-PCR对外排泵的表达量进行检测，探明外排泵与耐药之间的关系。另外，本研究中耐亚胺培南的87株菌中还有25株菌未检出相关耐药基因，外排泵初筛试验也阴性，可能存在少见或者新的耐药基因，有待于进一步研究。

综上所述，我院黏质沙雷菌对多种抗菌药物耐药率高，耐药机制复杂，临床应根据药敏结果规范合理使用抗生素，同时加强医院感染的监控，以减少耐药菌株的产生和播散。

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Profile and mechanism of imipenem resistance in clinical isolates of Serratia marcescens

GUO Pu, QIAO Yan, ZHANG Haitao, LI Jing. （Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233004, China）

ObjectiveTo investigate the profile and mechanism of imipenem resistance in the clinical isolates of Serratia marcescens.MethodsA total of 152 strains of S. marcescens were isolated from January 2013 to December 2014. Disk diffusion method and automated systems were used to determine the susceptibility of the isolates. The modifed Hodge test and EDTA synergy test were employed to test carbapenemase phenotype. Agar dilution method in combination with effux pump inhibitor MC207110 was used to observe the change of imipenem MIC values. The genes encoding carbapenemase, AmpC beta-lactamase and outer membrane protein were detected by polymerase chain reaction.ResultsImipenem resistance was identifed in 87 of the 152 strains of S. marcescens. Modifed Hodge test was positive for 12 of the 87 imipenem-resistant S. marcescens strains. EDTA synergy test was positive for 9 of the strains. Imipenem MIC was reduced to 1/4 to 1/64 in 46 strains by agar dilution method in presence of effux pump inhibitor MC207110. Five strains were positive for KPC genes, 8 strains positive for IMP gene, and 6 strains positive for DHA gene. Loss of outer membrane protein was found in 16 strains by PCR.ConclusionsImipenem-resistant strains of S. marcescens are prevalent in our hospital. KPC, IMP, DHA genes, and loss of outer membrane proteins and effux pumps may all contribute to imipenem resistance in S. marcescens isolates.

Serratia marcescens; imipenem; antimicrobial resistance

R978

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0187-05

10.16718/j.1009-7708.2017.02.013

2016-06-15

2016-09-08

安徽省高校自然科学研究一般项目（N O. KJ2015B011by）。

蚌埠医学院第一附属医院检验科，安徽蚌埠 233004；*感染性疾病科。

郭普（1976—），男，硕士，副主任技师，主要从事微生物感染与耐药研究。

郭普，E-mail：3504624902@qq.com。