山奈酚延缓db/db小鼠肾损伤研究

吴巧敏　倪海祥　卢笑　袁晓　骆阳阳　金雅美

【摘 要】：目的 观察山奈酚（KPF）干预自发肥胖2型糖尿病小鼠（db/db鼠）早期糖尿病肾病，并探讨相关机制。方法 24只健康雄性10周龄db/db鼠随机分为4组：不同剂量KPF给药组（50、200 mg/kg）、db/db对照组和二甲双胍（0.2 g/kg）阳性对照组，并设db/m对照组。连续灌胃给药10 周，检测小鼠血清肌酐（SCr）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），24小时尿白蛋白排泄率（UAER）；留取肾组织，作病理形态学检查、实时定量PCR检测肾组织TNF-α、IL-6的mRNA表达、Western blot检测磷酸化核因子κB p65（ p-NF-κBp65）、磷酸化核因子κB抑制蛋白α（p-IκBα）、核因子κB抑制蛋白α激酶（IKKα）蛋白的表达水平。结果 不同剂量KPF干预10周，都能使db/db小鼠24小时UAER、SCr、IL-6、TNF-α水平下降，肾组织IL-6、TNF-α基因表达水平明显降低（P<0.01、0.05），p-NF-κBp65、IKKα和p-IκBα蛋白表达水平下降（P<0.01）。结论 KPF可通过抑制核因子κB（NF-κB）介导的炎症反應，对自发2型糖尿病小鼠早期的肾脏损害起到保护作用。

关键词：山奈酚；糖尿病肾病；抗炎作用

中图分类号：R34 文献标识码：A 文章编号：1009_816x（2017）0？_？_0？

[Abstract] Objective To explore the effects of kaempferol（KPF）on renal tissues and to elucidate its underlying inflammatory molecular mechanism in db/db mice.Methods Twenty-four male db/db mice were randomly divided into four groups：Two groups were orally administered a low or high dose of KPF （50 or 200 mg/kg， respectively）， one control group and one positive control （metformin hydrochloride 0.2 g/kg） group. Six male db/m mice were set as normal control group. After 10 weeks treatment， 24 hour urinary albumin excretion （UAER）、SCr were detected； the gene expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α），and interleukin-6（IL-6） were measured by real time PCR； the protein expression of IKKα、phospho-IκBα、phospho-NF-κBp65 were evaluated by Western blotting.Results After 10 weeks of KPF treatment，the urinary albumin excretion and the SCr were reduced，the gene expressions of TNF-α and IL-6 were inhibited.Importantly， the protein expression level of IKKα、phospho-IκBα、phospho-NF-κBp65 in renal tissue was significantly decreased（P<0.01、0.05）. Conclusion ： Kaempferol has protective effects on renal tissues through inhibiting NF-κB pathway and related inflammation in db/db mice.

Key words： kaempferol； diabetic kidney disease ； anti-inflammation

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，其进展为终末期肾病（end-stage renal disease， ESRD）的速度较一般肾脏疾病更为迅速[1]，已成为血液透析治疗的最主要的原因。山奈酚（Kaempferol，KPF），是广泛存在于食物、中草药中的一种类黄酮化合物，已经有多项研究发现它具有防癌、抗癌、抗氧化、抗病毒及调节免疫等功效[2]。近年来多项体外试验及动物研究还表明它有抑制β细胞凋亡、改善胰岛素敏感性、抑制醛糖还原酶的活性、降低炎症反应及氧化应激等作用，在糖尿病及并发症的防治中有很大的应用前景[3～5]。然而，有关KPF防治DKD的动物研究报道很少。先天自发性肥胖2型糖尿病模型小鼠db/db鼠的糖尿病及DKD进程与人类2型糖尿病及肾病的早期表现极为相似，因此本研究选用该小鼠模型作为研究对象，观察KPF对2型糖尿病早期DKD的作用，并初步探讨可能的分子学机制，为筛选治疗DKD的药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：无特定病原体级健康雄性10周龄C57BL/KsJ db/db小鼠24只，对照db/m小鼠6只 （南京大学动物模式所），分别为39～44 g及19～22 g。饲养环境温度21～23℃，分笼标准颗粒饲料喂养，自由摄水，12 h交替照明。动物实验符合国家《实验动物管理条例》和《浙江省实验动物管理实施办法》要求。

1.1.2 主要试剂：KPF（HPLC测定质量分数≥99.0%，批号96353，美国Sigma）；二甲双胍（Metformin，上海信宜制药）；血生化测定试剂盒（德赛诊断系统上海有限公司）；尿蛋白测定试剂盒、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）测定ELISA试剂盒购自武汉贝茵莱；Trizol、PCR试剂盒、引物（美国，Thermo）；核转录因子κB（NF-κB），IKKα（美国，abcam），p-IκBα、p-NF-κB p65、GAPDH兔多抗（美国Cell Signal Technology），二抗羊抗兔等标记二抗（碧云天生物技术研究所）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组：：24只10周龄db/db小鼠，经适应性饲养1周后，应用葡萄糖氧化酶法检测小鼠血糖（BG），超过11.1 mmol/L的按照数字表法随机分为4组：实验对照组、两个不同剂量（50mg/kg、200 mg/kg）KPF实验组及二甲双胍（200mg/kg）阳性对照组，6只10周龄db/m小鼠作为空白对照组；KPF以植物油将其配成20mg/ml，二甲双胍用生理盐水配成20mg/ml；实验组小鼠每日17：00以相应药物及剂量灌胃1次，空白对照组和实验对照组则以相同的方式给予等量的植物油。持续用药10周。

1.2.2 标本的收集及检测：10周后，用代谢笼收集大鼠24 h尿液采用酶联免疫法测定尿白蛋白排泄率（UAER）；经心脏穿刺采血，采用日立全自动生化分析仪测定BG、SCr、甘油三酯（TG） 、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），应用ELISA法测定血清IL-6和TNF-α水平，由小鼠体重及右肾脏重量得出肾脏指数（KI，KI=右肾脏重量/小鼠体重）（mg/g）。用10%水合氯醛按0.04 ml/kg腹腔内注射麻醉，取肾组织用4%甲醛固定，用于病理學检测。

1.2.3 采用HPIAS-2000高清晰度彩色图文病理分析系统软件进行病理图像分析：在PAS染色中，每组选8个样本，每份样本均在40倍显微镜下，视野上、下、左、右、中各取2个肾小球（共10个）， 数码摄像头采集肾小球图像，在高倍镜下进行病理分析，每个切片随机选择10个正切的肾小球，测定肾小球平均截面积（MGA），取其平均值作为每个标本的MGA，采用Raij L[6]的半定量评分系统评价肾小球的损伤程度，计算肾小球硬化指数（GSI）。

1.2.4 实时定量PCR检测TNF-α、IL-6的mRNA表达：Trizol提取肾组织总RNA，反转录合成cDNA。荧光定量PCR技术检测TNF-α、IL-6基因转录水平，GAPDH作为内参，数据采用仪器自带软件分析：ABI Prism 7300 SDS Software进行各组间基因转录水平的比较。1.2.5 Western blot检测IKKα、p-IκBα及p-NF-κB p65蛋白的表达水平：以GAPDH作为内对照，进行各组间蛋白表达的比较，应用Image J分析目的蛋白及内参蛋白灰度值，计算相对灰度值，进行组间比较。

1.3 统计学处理

统计软件用SPSS 22.0统计分析软件。计量数据采用 （？X±S）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组小鼠生化及炎症指标比较： 与db/m组比较，db/db对照组小鼠BG与血脂、KI、SCr、UAER、血清IL-6和TNF-α水平都明显升高（P<0.01）；与db/db对照组相比，不同剂量KPF及二甲双胍的处理使小鼠BG及SCr、UAER、IL-6、TNF-α水平都有明显下降（P<0.01），但TG仅在二甲双胍组及大剂量KPF组有下降（P<0.05）， KI仅在二甲双胍组有下降（P<0.05），TC、LDL-C、HDL-C水平都没有下降（P>0.05），见表1和表2。

2.2 肾脏组织学观察 光镜下PAS染色结果显示，db/m组肾小球和肾小管结构正常，毛细血管清晰；db/db对照组肾小球肥大变形，内皮细胞数量明显增多，可见部分肾小管上皮细胞空泡变性、排列不整齐；与db/db对照组相比，不同剂量KPF治疗组、及二甲双胍阳性对照组肾小管和肾小球损害明显减轻，肾组织细胞数量减少，

2.3 肾小球截面积（GMA）和硬化指数（GSI）比较： 与db/m组比较，db/db对照组小鼠GMA和GSI都明显升高（P<0.01）；与db/db对照组小鼠比较，不同剂量KPF或二甲双胍处理都未能使GMA和GSI发生明显变化（P>0.05），见表2

3 讨论

DKD发病机制复杂，近年来，越来越多的证据显示炎症机制与DKD的发展密切相关，且认为DKD是一种炎症性疾病，阻断炎症反应的治疗方案，有可能成为治疗糖尿病肾病的新方法[7]。

本研究小组的前期研究发现[5]，SD鼠经高脂高糖饲料及链脲佐菌素（STZ）多次腹腔注射诱导制备2型糖尿病大鼠模型， 较正常对照组大鼠血清IL-6及TNF-a的水平都明显上升；在本研究中也发现db/db小鼠较db/m小鼠血清IL-6及TNF-a水平的明显上升。这些结果表明炎症因素在糖尿病及并发症发生和进展方面都有作用。经KPF处理10周后可明显降低高脂及STZ诱导的SD大鼠血糖水平，改善胰岛素抵抗，恢复血脂至正常水平，且伴有血清IL-6及TNF-a水平的明显下降[5]。在本实验中，以db/db小鼠为研究对象，同样的方法KPF或二甲双胍处理10周，血糖有明显下降，虽不能使小鼠血脂水平有改善，但小鼠尿蛋白排泄率及血肌酐有明显下降，也能明显降低小鼠血清IL-6及TNF-a水平，肾组织的IL-6 mRNA及TNF-a mRNA的表达水平也明显下降，且肾组织病理表现为肾小管和肾小球损害明显减轻，肾组织细胞数量减少。这些都表明KPF可通过抑制炎症因子的表达减轻db/db小鼠的肾脏损伤。另外，虽然同为啮齿类动物，高脂食物和药物诱导的2型糖尿病SD鼠和先天性瘦素受体基因突变的自发2型糖尿病小鼠db/db鼠对于KPF及二甲双胍这两种药物血脂的反应不同，可能同两种动物血脂升高的机理不完全相同有关，也可能与用药时间较短，以及实验动物数量较少导致的统计误差。

对于KPF抑制炎症因子表达的分子学机制，本实验进行了初步的探讨。已知有多种信号通路参与或介导DKD的炎症反应过程。核因子κB（Nuclear Factor-kappa B，NF-κB）是广泛存在于细胞质中的快反应转录因子，具有多向转录调节作用，可调控多种基因的表达，包括IL-6、TNF-a基因等，在DKD发病中起着重要作用[8]。越来越多的证据表明，NF-κB信号通路是许多DKD致病因素连接的细胞信号通路的核心[9]，是肾小球系膜细胞表达多种免疫炎症相关基因的调控枢纽。NF-κB的活化是一个非常复杂的过程，IkBa的磷酸化是NF-κB活化的关键。未活化的NF-κB存在于细胞质中，以P65亚基与IkB-a结合，覆盖在P50核定位信号上，在细胞中以P50-P65-IkB-IX多聚体的形式处于无活性状态。当细胞受到细胞因子、LPS、氧自由基等刺激时，激活IKKa使IkB-a磷酸化为p-IKBα从NF-κB复合物上解离，导致NF-κB活化进入细胞核中，与相应的靶基因相结合，从而产生大量炎性介质，引发炎症反应[10]。肾组织p-NF-κBp65、IKKα和p-IKBα升高，都提示NF-κB信号通路的激活。本研究发现，20周龄的db/db小鼠肾组织p-NF-KBp65、IKKα和p-IKBα蛋白表达水平较同龄的db/m小鼠显著上升；而经过50mg/kg或200mg/kg KPF每日灌胃10周处理的db/db小鼠，出现血糖下降，虽血脂未明显变化，但p-NF-KBp65、IKKα和p-IKBα蛋白的表达水平明显下降，伴随着肾组织IL-6及TNF-a mRNA的表达水平、血清IL-6及TNF-a水平明显下降，提示KPF可通过抑制NF-κB信号通路的激活，进而下调TNF-α、 IL-6等炎症因子表达起到抗炎、保护肾脏的作用。

本研究充分说明了KPF在治疗2型糖尿病早期肾脏并发症中的疗效，提示其可能成为DKD綜合治疗中的一个极具潜能的药物，也将为DKD的防治开辟一个新的途径。

参考文献

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（收稿日期：2016-11-21）