玄参中β葡萄糖苷酶活性测定条件及干燥过程中酶活性变化的研究

喻欢欢+吉光见稚代+胥秀英+郑一敏+李隆云

[摘要]采用pNPG法测定玄参中β葡萄糖苷酶的活性，通过单因素及均匀设计实验对提取液的种类、反应体系、反应时间、温度、以及底物浓度等提取条件与反应条件进行了筛选，并在此基础上测定了新鲜玄参在40～100 ℃干燥温度中酶活性的变化。结果显示，柠檬酸磷酸缓冲液提取效果较好，50 ℃环境下反应30 min时酶促反应产生的吸光度最大，均匀设计实验确定最佳提取液pH 70、酶反应体系pH 60、底物浓度20 mmol·L-1。酶活性变化受干燥温度和失水率影响，60～100 ℃干燥过程中温度升高，随着失水率加快酶活性迅速下降，而40，50 ℃干燥过程中一定的酶活性始终存在。该研究为环烯醚萜苷类水解机制和最佳干燥工艺的研究奠定了理论基础。

[关键词]玄参； β葡萄糖苷酶； 提取条件； 活性测定条件

Investigate optimum conditions and determinate changes of βglucosidase

activity in Scrophularia root under different drying conditions

YU Huanhuan1， YOSHIMITSU Michiyo1， XU Xiuying1， ZHENG Yimin1， LI Longyun2*

（1. School of Pharmacy and Bioengineering， Chongqing University of Technology， Chongqing， 400054；

2. Chonqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing， 400065）

[Abstract]To explore the optimum conditions of βglucosidase activity in Scrophularia root by using pNPG method The extraction conditions and reaction conditions （such as extraction liquid type， reaction system， reaction time， temperature， and substrate concentration） were screened by using monofactorial experiment and homogeneous design Then the changes of βglucosidase activity in Scrophularia root were detected at the drying temperature of 40100 ℃ The results showed that citric acid phosphate buffer had better extraction effect， and the maximum absorbance produced by enzymatic reaction was present at 50 ℃ environment after reaction for 30 min Homogeneous design experiment determined that the optimal conditions were as follows： optimal extraction liquid pH 70； enzymatic reaction system pH 60； substrate concentration 20 mmol·L1 The change of enzyme activity was affected by drying temperature and water loss rate In the drying temperature of 60100 ℃， the enzyme activity was reduced rapidly with the increase in water loss rate， while the activity was seen even with 0% of water at 40 and 50 ℃ This study has laid the theoretical foundation for research of hydrolysis mechanism of iridoid glycosides and optimum drying process

[Key words]Scrophularia root； βglucosidase activity； extraction conditions； activity testing conditions

玄參为玄参科植物Scrophulariacese玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根，是具有凉血滋阴、泄火解毒等功效的传统中药材[1]，主要成分为哈巴苷、哈巴俄苷、桃叶珊瑚苷与O甲基梓醇等环烯醚萜苷类。环烯醚萜苷类极易氧化或水解，并且环烯醚萜类苷键水解断裂和氧化聚合所生成的苷元很不稳定，同时引起颜色的变化[23]。在中药材干燥加工过程中，酶活性的变化是引起药材性味及化学成分发生转化的重要原因。据文献报道，在玄参不同炮制方法的研究中发现，水解酶活性对玄参中主要成分哈巴俄苷的含量具有潜在影响[45]，哈巴俄苷在干燥过程中可能使其肉桂酰基水解， 产生哈巴苷和肉桂酸[6]。另有研究发现哈巴苷、哈巴俄苷、桃叶珊瑚苷等环烯醚萜类化合物经β葡萄糖苷酶水解后具有抗炎活性[79]。可见玄参干燥过程中药材内在成分变化复杂，从而影响外观颜色以及药物功效。目前对于酶活性影响环烯醚萜苷水解机制的实验数据尚未见报道，阐明药材初加工过程中影响成分变化的机制，涉及到对干燥环境的合理控制，对提高玄参药材质量和稳定性具有重要意义。

本课题组围绕玄参在干燥过程中水解酶β葡萄糖苷酶的变化情况，以及在初加工过程中它对玄参药材质量的影响展开研究。本文首先采用β葡萄糖苷酶催化对硝基苯基βD葡萄糖苷（pNPG）法建立玄参中β葡萄糖苷酶活性测定方法，主要进行酶活性测定条件的探讨[10]，并根据筛选出的条件，考察不同干燥温度对玄参中的β葡萄糖苷酶活性的影响，为阐明玄参中的环烯醚萜苷类水解机制、寻找最佳干燥工艺提供理论依据。

1材料

2015年11月采于武隆仙女山玄参栽培基地，重庆市中药研究院李隆云研究员鉴定，玄参S ningpoensis的新鲜根。

对硝基苯βD葡萄糖苷（SigmaAldrich公司，批号BCBP2339V），对硝基苯酚（上海强顺化学试剂有限公司，批号20100121），柠檬酸（成都市科龙化工试剂厂，分析纯），磷酸氢二钠（广东省化学试剂工程技术研究开发中心，分析纯），柠檬酸钠（成都市科龙化工试剂厂，分析纯），碳酸钠（成都市科龙化工试剂厂，分析纯），双重蒸馏水。

全波长酶标仪（51119300，美国赛默飞）；离心机（Eppendorf AG 22331 Hamburg德国艾本德）；电热恒温培养箱（DHP9082，上海一恒科技有限公司）；鼓风干燥箱（DHG9123A，上海龙跃仪器设备有限公司）；电子天平（千分之一，JA1003N，上海精密科学仪器有限公司）；搅拌机（JYLC02V，九阳股份有限公司）。

2方法

21试剂制备

柠檬酸缓冲液：将01 mol·L-1柠檬酸溶液加入柠檬酸钠，测定其pH，即可；柠檬酸磷酸缓冲液：将01 mol·L-1柠檬酸溶液加入磷酸氢二钠，测定其pH，即可；底物：缓冲液加入pNPG溶液；停止液：1 mol·L-1碳酸钠溶液常规配制；对硝基苯酚标准液：常规配制。

22对硝基苯酚标准曲线的绘制[11]

以1 mol·L-1 碳酸钠溶液作为溶剂，配成037，594，2375，475，96 mg·L-1对硝基苯酚标准溶液。以1 mol·L-1 碳酸钠溶液为空白，在紫外可见区扫描对硝基苯酚的最大吸收峰，最大吸收波长400 nm。以对硝基苯酚质量浓度为横坐标，最大吸收波长下的吸光度为纵坐标，得出回归方程y=0026 3x+0076 5（R2=0999 4）。

23β葡萄糖苷酶粗酶活性测定

231粗酶液提取将10 g新鲜玄参洗净，切成小块，预冷至4 ℃，于搅拌机中制成匀浆。匀浆试料加入3倍量4 ℃预冷的缓冲液，于4 ℃提取4 h，4 000 r·min-1低温离心10 min，上清液12 000 r·min-1低温离心5 min，取上清于4 ℃贮存备用 [1213]。

232酶活性测定5～6 ℃下，在96孔酶标板中依次加入缓冲液20 μL、对硝基苯βD葡萄糖苷（pNPG）12 μL和粗酶提取液12 μL。将酶标板置于培养箱中反应一定时间，向反应体系中加入1 mol·L-1碳酸钠溶液50 μL终止反应，在400 nm波长下用酶标仪进行紫外吸收检测。每一个样品设置5个复孔，取平均值计算酶活性。空白对照：加入终止液之后加入底物，其余操作不变。β葡萄糖苷酶活性国际单位定义为以pNPG为底物， 在一定的分析條件下，每分钟释放出1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量[11]。

酶活性（U）=（YV2V）/（KV1Mt）

式中Y为酶促反应的吸光度；V为酶液的提取体积（mL）；V1 为反应体系中酶液体积（mL）；V2为总反应液体积（mL）；K为对硝基苯酚标准曲线的斜率；M为试样质量（g）；t为反应时间（min）。

24粗酶液提取条件的影响

按照23方法，设计2种提取缓冲液体系柠檬酸柠檬酸钠缓冲液与柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液，每种提取液pH分别为40，50，60，确定缓冲液种类之后考察其最适pH 50，55，60，65，70，75，80。反应体系： pH 50缓冲液，25 mmol·L-1 pNPG，37 ℃反应10 min。

25反应条件的影响

按照23方法，用pH 70柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液提取粗酶，不同酶反应环境下测定酶活力。考察缓冲液pH、底物浓度，反应温度、反应时间对酶活力的影响。

251反应溶液pH 缓冲液pH分别为25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75。反应体系： 柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液加入25 mmol·L-1pNPG，37 ℃反应10 min。

252反应温度在30，37，50，60，70 ℃ 5种温度条件下，反应体系： 柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液加入25 mmol·L-1 pNPG，10 min反应。

253反应时间酶反应经5，10，15，20，25，30，35，40 min后，反应体系pH 50缓冲液，25 mmol·L-1pNPG，37 ℃反应。

254pNPG浓度在不同pNPG浓度分为5，10，15，20，25，30 mmol·L-1，反应体系中底物浓度对酶活力。其他反应条件： pH 50缓冲液，50 ℃反应30 min。

26测定条件的优化

按照均匀设计法[14]，在单因素实验结果的基础上， 根据均匀设计表U6（64）及其使用表，运用拟水平法设计出以下混合水平的设计表U6（6×32），采用DPS705数据处理系统对均匀设计实验结果按二次多项式逐步回归方法进行分析。

27不同干燥温度下酶活性变化

将新鲜玄参去掉首尾部分，余下部分切成4～5小块，失水情况见图1，根据失水情况定时取样，分别测定干燥温度40，50，60，70，80，90，100 ℃下，失水率达到10%～100%的酶活性。失水率=（原质量-干燥后质量）/（原质量-干燥恒质量）；恒质量：对5块试料（1块215 g±25 g）的干燥前后平均质量差005 g以内。

3结果

31不同缓冲液对酶提取的影响

设计2种提取缓冲液体系，柠檬酸柠檬酸钠缓冲液和柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液，可见在此范围内随着pH增大，酶活力增大，且柠檬酸磷酸氢二钠处理的酶活性均明显高于柠檬酸柠檬酸钠，故选择柠檬酸磷酸氢二钠作为提取缓冲液较为合适。结果见图2。

32柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液pH对酶提取的影响

可见缓冲液pH对提取β葡萄糖苷酶会产生较大影响。当提取液为pH 70的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液时效果最好， 酶活力达到最大。结果见图2。

33酶反应环境对酶活力的影响

331反应溶液pH当反应体系pH 35～60时，测得的玄参中的β葡萄糖苷酶活力高，相对活性90%以上，可见随着pH升高，酶活力先增大后逐渐降低。

332反应温度可见50 ℃较其余温度条件下生成对硝基苯酚量最大。

333反应时间可见30 min时生成对硝基苯酚量最大。

334底物浓度可见pNPG浓度由5 mmol·L-1增加到25 mmol·L-1时酶活力逐渐增大，当达到30 mmol·L-1时，酶活力并未增加，故测定玄参中的β葡萄糖苷酶活力的最适底物浓度为25 mmol·L-1，结果见图3。

34测定条件的优化

341均匀设计采用DPS705数据处理系统对均匀设计实验结果按二次多项式逐步回归方法进行分析，Y=-10919 763 49+1022 050 935 2X3+0765 483 538 4X1X2-0251 365 022 23X1X3，其中相关系数r=0998 4，F=20203，P=0004 9，此表均衡性好。实验设计方案见表1。采用二次多项式逐步回归得到的方差P<005，有显著性意义，并得出X1，X2，X3的最佳组合为pH 60，pH 70，20 mmol·L-1。

342验证按22方法提取粗酶液，选择pH 70柠檬酸磷酸缓冲液作为粗酶提取液，其他条件不变，再将提取的粗酶液按照23方法测定β葡萄糖苷酶粗酶活性，在pH等于60的反应体系中，加

入浓度为20 mmol·L-1的 pNPG，于50 ℃培养箱中反应30 min，其余条件不变。重复3次酶活性测定结果分别为1267，1256，1273 U，表明优化后酶活性达到最大值。

35玄参β葡萄糖苷酶在不同温度干燥过程中酶活性的变化趋势

可见干燥温度50，60 ℃酶活力可高达25 U，其他温度环境下低于20 U，在40，50 ℃时，β葡萄糖苷酶活性在整个干燥过程中始终存在，但在60 ℃90%，70 ℃70%，80 ℃70%，90 ℃50%，100 ℃40%时已经失去酶活性，结果见表2。并且随着干燥温度与失水率的升高、酶活性降低速度呈加快的趋势，结果见图4。

4讨论

本实验采用pNPG法测定β葡萄糖苷酶活性，根据单因素考察及均匀设计实验优化结果确定玄参中β葡萄糖苷酶提取及活性测定的最佳条件。结果表明用pH为70的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液对玄参中β葡萄糖苷酶的提取效果最好，酶活性测定时，选用pH 60的反应体系，pNPG浓度20 mmol·L-1，在50 ℃下反应30 min，所测得酶活性最大。一般观点认为β葡萄糖苷酶37 ℃条件下酶活力和反应时间有良好的关系，但玄参中的β葡萄糖苷酶在50 ℃30 min反应条件下活性高，与37 ℃条件下反应60 min的吸光度相近，并且反应时间30 min内和酶活性的线性关系较好，y=0025 1x+0439 6，R2=0979 3。因此，结果表明玄参中的β葡萄糖苷酶的最适温度比较高。

在此基础上测定了不同干燥条件下，玄参中β葡萄糖苷酶活性的变化情况，新鲜玄参在高温环境下，随着干燥温度升高以及内部水分的急剧降低，酶活性也快速降低，但40，50 ℃环境下，即使玄参失水率升高却依然保持酶活。根据一般药材内的水分活性在03～08 Aw时，酶具有活性，推断玄参在40，50 ℃环境下，即使干燥至100%，药材内部的水分活性并没有随着水分流失而降至最低点，该结果提示环境温度对玄参中β葡萄糖苷酶的活性影响大。

中药材多数为干燥品，故干燥方法的差异对质量有较大的影响，目前中药材玄参的质量稳定性本就较难保持，所以必须严格控制初加工过程中的质量影响因子。

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[责任编辑孔晶晶]

[收稿日期]20160914

[基金项目]国家科技支撑计划项目（2011BAI13B022）；重庆市科技研发基地项目（cstc2014ptyjd10001）；科技富民强县专项行动计划项目（国科发农[2014]160号）；重庆市基本科研业务项目（2015cstcjbky01903）

[通信作者]*李隆云，研究员，主要从事中药材栽培技术、品种选育与质量评价研究，Tel：（023）89029118，Email： lilongyun8@163com

[作者简介]喻欢欢，硕士研究生，主要从事天然药物研究，Email： yuhuanhuan@outlookcom