白虎加桂枝汤对热痹模型大鼠特征性甲基化基因表达的影响

陈欢+巨少华+魏江平+付文君+郑航+徐世军

[摘要]考察濕热环境下热痹模型大鼠特征性甲基化基因及白虎加桂枝汤对热痹特征性甲基化基因的调控作用。采用大鼠足底注射CFA并复合湿热环境制备热痹大鼠模型。造模后第15天给予白虎加桂枝汤干预治疗30 d。造模后每隔4 d检测足容积，第45天采用HE染色法检测大鼠踝关节组织病理学，MeDIPSeq测序法检测大鼠膝关节滑膜甲基化水平并以取差集的方法筛选热痹模型特征性甲基化基因，悬浮芯片检测血清中IL1β，IL17，TNFα，EGF，IL12p70，IL4，IL6及IFNγ含量水平，qRTPCR检测大鼠滑膜特征性甲基化基因mRNA相对表达水平。实验发现，与完全弗氏佐剂性关节炎（AA）模型组比较，热痹模型组足肿胀度和病理严重程度仅轻微增加；与空白组比较，2个模型组全基因CpG岛均呈低甲基化状态，热痹模型组甲基化水平最低，且AA模型组共705个差异性甲基化基因，热痹模型组共2 418个差异性甲基化基因；与AA模型组比较，热痹模型组存在1 287个差异性甲基化基因，其中共974个差异性基因甲基化下调，这些差异性基因显著分布于32个KEGG Pathway中（P<005），此外启动子区上热痹特征性甲基化基因共52个，其中36个甲基化下调基因，16个甲基化上调基因；药物干预后，白虎加桂枝汤显著改善热痹模型组足肿胀度和病理损伤，且明显降低IL1β，TNFα，EGF，VEGF，IL17，IL12p70的含量水平（P<005），还能抑制热痹特征性甲基化下调基因Ahcy及Rpl3 mRNA的表达，促进热痹特征性甲基化上调基因Agxt mRNA的表达水平。可见，热痹模型滑膜基因存在独特的甲基化水平变化，而白虎加桂枝汤可能针对性回调热痹特征性基因的甲基化水平，达到治疗热痹的作用。

[关键词]热痹； DNA甲基化； 湿热环境； 白虎加桂枝汤

Effect of Baihu Guizhi decoction on characteristic methylation genes

expression of pyretic arthralgia rat model

CHEN Huan1，2， JU Shaohua1，2， WEI Jiangping1，2， FU Wenjun1，2， ZHENG Hang1，2， XU Shijun1，2*

（1 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；

2 Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine Resources in Sichuan Province，

Chengdu 611137， China）

[Abstract]To investigate the characteristic methylation genes of pyretic arthralgia model in hot and dampness environment and the regulation effect of Baihu Guizhi decoction on this characteristic methylation genes Plantar injection of CFA was used in hot and dampness environment to induce the pyretic arthralgia rat models From 15th day after modeling， Baihu Guizhi decoction was given for 30 days Foot volume was detected every 4 days after modeling， and HE staining was used to detect the histopathology of all rats′ ankle joint at day 45MeDIPSeq sequencing method was used to detect the methylation level of knee joint synovial， and the method of difference sets was used to screen the characteristic methylation genesinpyretic arthralgia modelsThe contents of IL1β， IL17， TNFα， EGF， IL12p70， IL4， IL6 and IFNγ in serum were measured by using suspension chips The mRNA expression level of characteristic methylation genes was measured by qRTPCR The results suggested that as compared with adjuvant arthritis rat models（AA）， the foot swelling and histopathology inpyretic arthralgia models （PA） were only slightly increased As compared with normal group （NG）， the wholegenome CpG island in both AA and PA groups was kept in a lower methylation state， furthermore， the methylation level was lowest in PA group； with 705 difference methylation genes in AA group and 2 418 difference methylation genes in PA group As compared with AA， there were 1 287 difference methylation genes， including 974 downregulated methylation genesand 313 upregulated methylation genes This difference methylation genes were mostly enriched in 32 KEGG pathways Moreover， there were 52 characteristic methylation genes of PA models in promoter region， including 36 downregulatedmethylation genes and 16 upregulatedmethylation genes After drug intervention， Baihu Guizhi decoction improved the foot swelling and pathological injury in PA models， significantly decreased the levels of IL1β， TNFα， EGF， VEGF， IL17， IL12p70， inhibited the mRNA expression levels of downregulated methylation genes AHCY and RPL3， and promoted the mRNA expression levels of upregulated methylation gene Agxt In conclusion， unique methylation changes of synovial genes were present in PA models， and Baihu Guizhi decoction may adjust the methylation level of PA′s characteristic methylation genes to achieve the therapeutic effect of pyretic arthralgia

[Key words]pyretic arthralgia； DNA methylation； hot and dampness environment； Baihu Guizhi decoction

痹证是中医临床常见的病症，其多因正气不足，感受风、寒、湿、热等外邪引起，由此可见，外界风寒湿热等环境因素与痹证的发生密切相关，而湿与热又常作为热痹发病的诱因之一。表观遗传学作为环境因素影响基因表型的中间桥梁，常用于研究疾病的发病机制，其中DNA甲基化研究最为广泛[1]。与疾病发生相关的基因启动子区甲基化水平降低，导致致病基因表达增加，诱发或促使疾病发生，可见基因启动子区甲基化水平与基因的表达水平呈负相关[23]。白虎加桂枝汤是治疗热痹的经典方剂，其药理学机制主要集中于调节机体免疫和缓解炎症反应[45]，是否还存在其他的治疗机制仍需进一步研究。完全弗氏佐剂性关节炎大鼠（AA）模型其病理表现与人类类风湿性关节炎（RA）十分相似，常作为研究RA发病机制的动物模型[6]，而RA在中医认知中，将其归属与“痹证”范畴，根据 “病因模拟”原理，本实验在经典AA模型的基础上复合湿热环境，制备符合中医热痹证候的动物模型，并在此基础上采用甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIPSeq）测序方法考察了热痹特征性甲基化基因，并初步探讨了白虎加桂枝汤治疗热痹的表观遗传学机制。

1材料

11动物

SPF级SD大鼠，体重180～220 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物合格证号SCXK（川）201324。

12药物与试剂

白虎加桂枝汤，其药物组成及用量参考上海中医学院1982年版《中医方剂与临床手册》，为石膏60 g、知母15 g、甘草5 g、粳米30 g、桂枝10 g。药材均购于成都市荷花池药材市场，由成都中医药大学马云桐教授鉴定。药物配制方法如下：知母、甘草、粳米、桂枝温水浸泡1 h，石膏单独先煎30 min后加入其他药物，加水至1 000 mL，保持微沸，煎煮30 min，纱布过滤；取药渣加水500 mL二次煎煮20 min，纱布过滤并与第一次滤液合并，浓缩至2 g·mL-1，各给药组均以2 g·mL-1溶液稀释至给药浓度。

醋酸地塞米松（浙江仙琚制药股份有限公司，20140609）；完全弗氏佐剂（CFA）（Sigma，F588110 mL）；MILLIPLEX xMAP Rat Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Immunology Multiplex Assay Kit （Millipore，USA，RECYTMAG65K11）；Magnetic Methylated DNA Immunoprecipitation kit（Millipore，ME10025）；QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，155231102）；PairedEnd DNA Sample Prep kit（Illumina，PE1021002）；iScript cDNA Synthesis Kit（BIORAD，100 reaction）；FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）（Roche，5 mL）；TriPure Isolation Reagent（Roche，200 mL）。

13仪器

Luminex 200（Millipore，Magpix）；Nanodrop（Thermo Scientific Co Ltd，2000）；Illumina Hiseq（Illumina，2000）；实时荧光定量 PCR仪（Applied Biosystems Inc，7900 HT）；紫外分光光度计（Thermo Scientific，NANODROP2000）；凝胶成像仪（GE，ImageQuant300）。

2方法

21分组与造模

60只SD大鼠剔除体重不合格者4只，其余54只大鼠随机分为7组，每组8只，分组为：空白组（NG）、完全弗氏佐剂性关节炎模型组（AA）、热痹模型组（RB）、地塞米松组（DXM）、白虎加桂枝汤高剂量组（BHG）、白虎加桂枝汤中剂量组（BMG）、白虎加桂枝汤低剂量组（BLG）。各组大鼠于常规实验环境下适应性喂养3 d。造模方法如下：除NG组大鼠右后足底皮下注射01 mL生理盐水外，其余各组均注射01 mL CFA。RB，BHG，BMG，BLG 4组大鼠自注射01 mL CFA第1天起，均置于温度为375 ℃，相对湿度为70%～80%的环境中，每天2 h，直至45 d，其余时间常规饲养。

22给药

造模15 d后，DXM（5 mg·kg-1），BHG（28 g·kg-1），BMG（14 g·kg-1），BLG（7 g·kg-1）4组大鼠按20 mL·kg-1体积灌胃给药，每天1次，连续30 d。

23大鼠足肿胀度的测定

测定造模前和自造模后第6天起，每隔4 d后大鼠的足容积。足肿胀度计算公式为：造模后足容积-正常足容积。

24大鼠踝关节滑膜组织病理学检测

第45天给药后，剪取大鼠踝关节，10%甲醛固定，10%EDTA脱钙，乙醇梯度脱水，二甲苯脱酒精，石蜡包埋，切片（5 μm）；切片脱蜡，苏木素伊红染色，封片，镜检。

25大鼠血清因子含量水平检测

造模后第35天，各组大鼠尾静脉取血并分离血清。按照MILLIPLEX xMAP Rat Cytokine/Chemokine Magnetic Bead PanelImmunology Multiplex Assay Kit說明书检测血清中IL1β，IL17，TNFα，EGF，IL12p70，IL4，IL6及IFNγ的含量水平。

26热痹模型大鼠滑膜甲基化水平检测及热痹特征性甲基化基因筛选

根据NG，AA及RB 3组大鼠血清因子检测结果，根据IL1β，TNFα，EGF，VEGF，IL17及IL12p70的结果，做聚类分析，剔出3组中各自离散度大的动物，各筛选出3只大鼠进行后续试验。造模后第44天，处死NG，AA及RB 3组中挑选出的大鼠，取膝关节滑膜。按照QIAquick Gel Extraction Kit说明书中组织样本DNA提取方法，提取各大鼠滑膜DNA，并将DNA样本立刻送华大基因进行MeDIPSeq测序。将NG相对RB启动子区甲基化基因和 NG相对AA启动子区甲基化基因以取差集的方式，找出热痹模型特征性甲基化基因。

27白虎加桂枝汤对热痹模型大鼠滑膜特征性甲基化基因表达的影响

造模后第45天，剥离大鼠后肢膝关节滑膜，并提取总RNA，逆转录为cDNA，作为模版进行PCR。扩增引物为：βactin上游引物为5′CTGGAGAAGAGCTATGAG3′，下游引物为5′ATGATGGAATTGAATGTAGTT3′；Ahcy上游引物为5′GTCCACAACCTCTACA3′，下游引物为5′CTTGGTGACAGAATCG3′；Rpl3上游引物5′AACAGAGATCAACAAGAAGA3′，下游引物为5′CAGGTCGTAGTCAGTAGA3′；Agxt上游引物为5′GAAGTCTGAGGATGATTGG3′，下游引物为5′TCTGGAACACATACTGGAT3′。

反应体系：5x iScript Reaction Mix 12 μL，iScript Reverse Transcriptase 3 μL，Nucleasefree water 30 μL，RNA template 15 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反应40个循环，整个荧光定量PCR通过ABI 7900 HT Realtime PCR System以及7900 System SoftwareSDS 24（Applied Biosystems）进行。

28统计方法

数据均采用±s表示，数据采用单因素方差分析及非参数检验；DNA甲基化数据采用R语言、PCA和FC的计算方法；分析2组样品间的 peak 相关差异基因，采用卡方检验，并做 FDR 检验去除假阳性。

3结果

31各检测时间点大鼠足肿胀度变化

与NG组比较，AA组与RB组足肿胀度显著升高（P<005）；与AA组比较，RB组足肿胀度于各检测点仅有升高趋势，第21天最明显，但无统计意义；与RB组比较，白虎加桂枝汤高、低剂量组给药30 d后，足肿胀度明显降低（P<005），见表1。

32大鼠踝关节滑膜病理变化

病理结果显示，NG组大鼠踝关节滑膜正常；AA组较NG组可见滑膜轻度增生、滑膜细胞轻度肿胀，

滑膜炎性细胞中度浸润，轻度纤维化；RB组可见滑膜细胞增生和炎性细胞浸润较AA组严重，但未见滑膜细胞肿胀及纤维化；给予药物白虎加桂枝汤干预后，滑膜炎性增生和浸润明显改善，见图1。

33白虎加桂枝汤对大鼠血清炎症因子含量水平的影响

与NG比较，AA和RB 2组大鼠血清各因子含量均明显升高（P<005）；与AA比较，RB大鼠血清中IL1β，TNFα和VEGF的含量顯著升高（P<005）；与RB比较，BHG，BMG显著降低IL1β，TNFα，EGF，VEGF，IL17及IL12p70的含量水平（P<005），而BLG对VEGF和IL12p70的含量水平无明显降低作用。IL6，IL4和IFNγ因其浓度低于检测线，未检测出，见图2。

34热痹模型大鼠滑膜甲基化水平

341MeDIPSeq序列与参考序列的比对NG，AA及RB 3组大鼠滑膜DNA甲基化测序完成后，统计质量合格的read产出量，3组reads数量产出量均为244，897，960条。与参考基因组进行比对（比对软件SOAP221，相关网站http：//soap.genomics.org.cn），每条read最多允许2个碱基错配，可见3组reads比对率均不低于93%。比对结果见表2。

342reads在CpG Island及其上下2 000 bp的平均覆盖深度分布趋势CpG岛甲基化程度与基因表达存在十分密切的联系，本实验结果说明，与NG比较，AA及RB组CpG岛DNA甲基化水平均明显降低，且RB组低甲基化状态最明显，见图3。

343热痹模型DNA甲基化密度分布情况及各组

差异性甲基化基因将reads映射至参考基因组上，检测甲基化reads分布的峰值peak，并进一步分析各组甲基化peak在不同基因元件上的密度。结果表明，NG，AA及RB的peak总数分别为253，285，233，338和233，461，与NG比较，AA及RB各基因元件上甲基化密度均减少；而与AA比较，RBUpstream2k，CDS与Intron上甲基化密度增加，而5′UTR，3′UTR和Downstream2k甲基化密度减少，见表3。

合并各组样本peak区域，统计合并后区域中每个样本归一化后的reads数，并采用FDR检验去除假阳性结果。根据所选定区域中reads数的差异，将差异区域分为上升和下降，如样本1与样本2比较，同一peak区域中样本2的reads数高于样本1的reads数的基因，则认为甲基化上调（up），反之为甲基化下调（down）。筛选准则为：P≤001，2个样本在相同基因元件内都有覆盖，且覆盖度的差异在2倍以上。结果显示，NG相对AA共有390个甲基化上调基因，315个甲基化下调基因，NG相对RB共有307个甲基化上调基因，2 111个甲基化下调基因；AA相对RB共有313个甲基化上调基因，974个甲基化下调基因。结果见图4。

344热痹差异性甲基化基因相关KEGG Pathway分析将RB相对AA的差异性基因投射于KEGG Pathway公共数据库[7]上，通过pathway显著性富集分析，得到RB相对AA的差异性 KEGG通路。由结果可知，RB差异性甲基化基因主要富集到细胞黏附、钙信号途径、MAPK信号通路、T，B细胞受体信号通路、抗原提呈处理等32个通路上。结果见表4。

345热痹特征性甲基化基因采用整合基因组学浏览器（IGV）检测MeDIPSeq测序的原始数据中的wig压缩包，剔除组内3个样本在peak相同区域内存在较大差异的甲基化基因，再经过取差集的方法筛选启动子区发生差异性甲基化的基因后，分析方法见图5，得到热痹特征性甲基化下调基因36个，甲基化上调基因16个。热痹特征性甲基化基因见表5。

35白虎加桂枝汤对热痹模型特征性甲基化基因表达的影响

检测白虎加桂枝汤不同剂量对热痹特征性甲基化上调基因AGXT及甲基化下调基因AHCY和RPL3 3个基因mRNA表达水平的影响。结果表明与RB比较，BHG与BLG均能降低Ahcy基因mRNA表达水平；BHG，BMG，BLG均能下调Rpl3基因mRNA表达水平；而对于甲基化上调的Agxt，BHG与BMG均能提高Agxt基因mRNA表达水平，见表6。

4讨论

风寒湿热是痹证重要的发病病因。中医将RA归属于痹证，在以往的实验研究中发现，湿热环境能使RA模型大鼠滑膜细胞增生程度、CD44表达水平增加，导致RA炎症和免疫反应加重[89]。本实验在经典RA大鼠模型基础上复合湿热环境，制备热痹大鼠模型。与申洪波[9]、镇兰芳[10]等的研究相比，本实验表明，给予湿热环境刺激后大鼠足肿胀度及滑膜病理严重程度仅有轻微增加，其原因可能是每日造模时间相对较短，致使湿热环境对AA模型的作用减弱。

研究表明，DNA甲基化可能改变RA发病关键基因的甲基化修饰水平，而参与到RA发病过程中，如CD4+T细胞全基因组出现低甲基化模式[11]，DNA甲基化动态的参与到患者滑膜Th细胞的分化过程中等[12]。本实验研究结果表明，在CPG岛上

AA模型较NG组呈明显低甲基化状态，而湿热环境刺激后，RB组低甲基化状态进一步扩大，此结果与文献报道相一致[13]。另外，在基因的各区域中RB较AA大鼠，甲基化下调基因数目均明显多于甲基化上调的基因数目。热痹模型甲基化水平低于AA模型的结果和足肿胀度、踝关节病理的结果，说明低甲基化状态可能是湿热环境推动AA模型疾病进程的原因之一。KEGG Pathway分析结果显示，RB与AA的差异性甲基化基因主要集中与炎症、免疫相关的通路上，如细胞黏附、钙信号途径、MAPK信号通路、T，B细胞受体信号通路、抗原提呈处理等，说明湿热环境可能通过对这些炎症免疫通路的作用，影响疾病的转归。此外，除了炎症和免疫通路，这些差异性甲基化基因还富集到某些物质合成及代谢通路上，说明湿热环境另一方面可能造成生物机体代谢系统紊乱引发或加重疾病。

本实验通过对基因启动子区域取差集的方法（NG相对RBNG相对AA），扣除了RB与AA因reads倍数差异而共同拥有的甲基化基因，进而得到热痹特有的甲基化基因，第一次阐述了热痹滑膜基因存在独特甲基化变化，这些基因主要编码与炎症免疫反应（如Ahcy，Rpl3，Crn2，Map3k14，Stat2）、能量代谢（Fut2，Kcnj11，Stat2）、DNA及RNA转录（Sertad1）、细胞成分（Sertad1）等相关的蛋白，与关節炎，自身免疫性疾病，代谢紊乱等疾病有关。说明湿热环境可能通过特异性改变这些基因的甲基化水平，参与到热痹疾病进程中。

白虎加桂枝汤抗炎和提高机体免疫能力效果显著[1415]。本实验从减轻热痹大鼠足肿胀度、踝关节滑膜炎性细胞浸润、滑膜细胞增生及降各炎症因子含量三方面，证明了白虎加桂枝汤抗炎作用明显。除此之外，首次从表观遗传学角度探讨了其对热痹特征性甲基化基因表达水平的影响。众所周知，基因启动子区域发生甲基化程度与基因的表达水平呈负相关[16]。本实验表明，白虎加桂枝汤能上调热痹特征性甲基化上调基因AGXT的表达水平，下调热痹特征性甲基化下调基因AHCY和RPL3的表达水平，其中AGXT编码的蛋白参与cAMP，丝氨酸转氨酶活性，丙氨酸代谢等过程，而RPL3编码的蛋白参与细胞对IL4反应过程和转录过程中，AHCY编码的蛋白参与抗原刺激性炎症反应，实验性关节炎等过程。以上结果说明，白虎加桂枝汤可能影响热痹特征性基因的甲基化水平扭转因外界湿热环境引起的甲基化异常变化，这可能是白虎加桂枝汤治疗热痹的表观遗传学机制之一。当然，实验还需要进一步完善，如检测白虎加桂枝汤各剂量组大鼠滑膜全基因组甲基化水平，并和热痹模型组全基因组甲基化进行对比，以及考察白虎加桂枝汤对多个热痹特征性甲基化基因表达的影响等。

[参考文献]

[1]Liu L， Li Y， Tollefsbol T OGeneenvironment interactions and epigenetic basis of human diseases[J] Curr Issues Mol Biol， 2008，10： 25

[2]Cribbs A， Feldmann M， Oppermann U Towards an understanding of the role of DNA methylation in rheumatoid arthritis： therapeutic and diagnostic implications[J] Ther Adv Musculoskel Dis， 2015， 20（15）： 1549

[3]Kass S U， Landsberger N， Wolffe A P DNA methylation directs a timedependent repression of transcription initiation[J] Curr Biol， 1997， 7（3）： 157

[4]徐世军，李磊，张文生，等基于方证相关理论的治“痹”经方药效学比较研究[J]中国中药杂志，2009， 34（23）：2030

[5]巨少华，陈欢，魏江平，等基于"以方测证"思路的治痹经方抗风湿性关节炎大鼠的比较药理学研究[J]中药药理与临床，2015，31（6）：4

[6]陈哲，郭艳幸类风湿关节炎实验动物模型研究综述[J]风湿病与关节炎，2015，4（12）：67

[7]Kanehisa M， Araki M， Goto S， et al KEGG for linking genomes to life and the environment[J] Nucleic Acids Res， 2008， 36（suppl 1）： D480

[8]镇兰芳，宋玉，张六通外感风寒湿热对胶原誘导关节炎大鼠血清CD44水平的影响[J]辽宁中医药大学学报，2013，15（10）：159

[9]申洪波，白云静，胡荫奇环境因素对痹证大鼠自身抗体表达的影响[J]中国中医基础医学杂志，2010，16（9）：832

[10]镇兰芳，外感风寒湿与痹证相关性的理论和实验研究[D]武汉：湖北中医药大学，2014

[11]Janson P C J， Linton L B， Bergman E A， et al Profiling of CD4+T cells with epigenetic immune lineage analysis[J]J Immunol， 2011， 186（1）： 92

[12]Cohen C J， Crome S Q， MacDonald K G， et al Human Th1 and Th17 cells exhibit epigenetic stability at signature cytokine and transcription factor loci[J] J Immunol， 2011， 187（11）： 5615

[13]Saxonov S， Berg P， Brutlag D L A genomewide analysis of CpG dinucleotides in the human genome distinguishes two distinct classes of promoters[J] Proc Natl Acad Sci USA， 2006， 103：1412

[14]徐世军，代渊，李磊，等基于“方证相关”理论的治“痹”经方调控T细胞亚群比较研究[J]中国中药杂志， 2010（15）：2030

[15]徐世军，李磊，张文生，等基于“方证相关”理论的治“痹”经方调控TLR/TRAF信号通路的比较研究[J]中国中药杂志，2010（8）：1025

[16]Cribbs A， Feldmann M， Oppermann U Towards an understanding of the role of DNA methylation in rheumatoid arthritis： therapeutic and diagnostic implications[J] Ther Adv Musculoskel Dis， 2015， 20（15）： 1549

[责任编辑张宁宁]

[收稿日期]20161009

[基金项目]国家自然科学基金面上项目（81273900）；中药药理四川省青年科技创新研究团队（2014TD0007）

[通信作者]*徐世军，Tel：（028）61800231，Email：docxu@126com

[作者简介]陈欢，博士研究生，主要从事中药抗炎与免疫药理学研究，Email：rata555@163com