龙州山橙的生物碱类成分研究

鲁兖+沈耐涛+虞和永

[摘要]对龙州山橙的生物碱类成分进行研究。采用硅胶柱色谱、反相柱色谱、高效制备液相等方法，对龙州山橙的总生物碱进行分离和纯化，并通过1H，13CNMR，MS等波谱方法鉴定化合物的结构。该研究共分离得到7个生物碱类化合物，分别为scandine（1），tabersonine（2），melodinine N（3），melodinine P（4）， melodinine T（5），19epimeloscandonine（6），16hydroxy19Svindolinine（7）。化合物均1～7为首次从该植物中分离得到。采用MTT 法对分离得到的化合物进行体外抗肿瘤活性评价，发现化合物1～7均表现出一定的体外细胞毒活性。

[关键词]山橙属； 龙州山橙； 生物碱； 抗肿瘤活性

Studies on alkaloids from Melodinus moraei

LU Yan， SHEN Naitao， YU Heyong*

（The Fourth Affiliated Hospital， College of Medicine， Zhejiang University， Yiwu 322000， China）

[Abstract]To study the alkaloids from Melodinus moraei，seven compounds were separated and purified by column chromatography over silica gel， reverse phase silica gel and preparative HPLC Their chemical structures were elucidated by MS and spectral data （1HNMR， 13CNMR） as scandine（1），tabersonine（2），melodinine N（3），melodinine P（4）， melodinine T（5），19epimeloscandonine（6），16hydroxy19Svindolinine（7） Compounds 17 were isolated from M moraei for the first time.The bioassays showed all tested samples displayed antitumor activity against the cell lines such as A549，PC3，HGC27 and HL60

[Key words]Melodinus； Melodinus moraei； alkaloids； antitumor activity

山橙属植物全球约有53个种，主要分布在亚洲热带地区及大洋洲，我国有11个种，华南、西南及台湾等省或地区为主要产地[1]。该属植物富含单萜吲哚生物碱类成分，该类生物碱结构复杂新颖，生物活性显著，近年来引起了一些学者的关注[24]。龙州山橙Melodinus moraei Tsiang，系夹竹桃科山橙属植物。该属植物全球约有53个种，主要分布在亚洲热带地区及大洋洲，我国有11个种，华南、西南及台湾等省区为主要产地[1]。山橙属植物富含单萜吲哚生物碱类成分，该类生物碱结构复杂新颖，生物活性显著，近年来引起了一些学者的关注[24]。龙州山橙主要分布于广西，民间常用于治疗脑膜炎、风湿性心脏病等[5]。目前对龙州山橙化学成分的研究报道较少，因此研究龙州山橙的生物碱类成分是一项非常有意义的工作， 可藉此发现具有药理活性的前体化合物用于药物研制。利用硅胶柱色谱，反相柱色谱，制备液相色谱等分离手段，对龙州山橙的生物碱类成分进行了系统研究，并从中分离得到了7个化合物。分别鉴定为scandine（1），tabersonine（2），melodinine N（3），melodinine P（4）， melodinine T（5），19epimeloscandonine（6），16hydroxy19Svindolinine（7）。化合物均1～7为首次从该植物中分离得到。

1材料

11仪器Bruker DRX500 MHz 核磁共振波谱仪（瑞士，TMS为内标）；Agilent Technonlgies 6520 质谱仪（美国），LABOROTA 4000旋转蒸发仪（德国海道夫公司），Shimadazu LC6AD制备型高效液相色谱仪（日本岛津公司），YMC ODSA （20 mm×250 mm， 5 μm）色谱柱。

色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；反相Rp18硅胶（德国默克公司）；提取分离用试剂均为分析纯；制备HPLC用乙腈为色谱纯（瑞典Oceanpak公司），水为重蒸水。

12细胞株实验所用的肺癌A549，前列腺癌PC3，胃癌HGC27 和白血病细胞HL60细胞株均购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

13药材样品采于2013年采自广西龙州，经虞和永教授鉴定为龙州山橙M moraei。

2提取分离

龙州山橙干燥茎枝5 kg，粉碎，用95%加热回流提取3次，每次2 h，浓缩后得总浸膏450 g。浸膏溶于2%盐酸中，过滤，滤液用氨水碱化，调pH 9～10，然后用氯仿萃取，回收氯仿，得总生物碱56 g。总生物堿经碱性硅胶柱色谱，氯仿甲醇洗脱。得到A～E 5个部分。其中C部分进一步利用反相硅胶柱色谱、制备液相色谱（乙腈水为流动相，45∶55），分别得到化合物1（15 mg，tR=98 min），2（9 mg， tR=125 min），3（10 mg，tR=227 min）和 4（26 mg，tR=421 min）。D部位经硅胶柱色谱（环己烷乙酸乙酯二乙胺，6∶4∶1）得到化合物5 （12 mg）。E部位经硅胶柱色谱分离，以氯仿甲醇（8∶1）洗脱，得E1～E8部分，其中E2部分有白色固体析出，过滤重结晶得到化合物6 （34 mg），其母液再经过制备液相色谱纯化得化合物化合物7 （18 mg）。

3结构鉴定

化合物1淡黄色粉末。ESIMS m/z 3510 [M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz） δ：369（1H，m，H3a），333（1H，dd，J=180 Hz，90 Hz，H3b），362 （1H，m，H5a），360 （1H，m，H5a），389 （1H，m，H6a），381 （1H，m，H6b），782 （1H，d，J=45 Hz，H9），722 （1H，d，J=75Hz，H10），721 （1H，d，J=75 Hz，H11），690 （1H，d，J=75 Hz，H12），574 （1H，m，H14），592 （1H，d，J=100 Hz，H15），312 （1H，d，J=135 Hz，H17a），265 （1H，d，J=135 Hz，H17b），575 （1H，m，H18a），500 （1H，dd，J=175，105 Hz，H18b），564 （1H，dd，J=175，105 Hz，H19），290 （1H，s，H21）；13CNMR （CDCl3，125 MHz） δ：1673 （C2），450 （C3），531 （C5），389 （C6），591 （C7），1281 （C8），1292 （C9），1245 （C10），1274 （C11），1158 （C12），1346 （C13），1221 （C14），1310 （C15），624 （C16），440 （C17），1153 （C18），1402 （C19），459 （C20），839 （C21），1692 （C=O），529（OCH3）。以上数据与文献[6]对比，故鉴定化合物1为scandine。

化合物2淡黄色粉末。ESIMS m/z 3373 [M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz） δ：074（3H，s，H18），126 （2H，dd，J=125 Hz，H19），376 （3H，s，OCH3 ），575 （1H，d，J=100 Hz，H15），590 （1H，s，H14），597 （1H，s，H12），682 （1H，d，J=65 Hz，H11），724 （1H，s，H10），790 （1H，br s，H9），901 （1H，s，NH）。以上数据与文献报道[7]数据对比，鉴定化合物2为tabersonine。

化合物3白色粉末。ESIMS m/z 3693[M+H]+。1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ：301（1H，s，H3a），342（1H，d，J=130 Hz，H3b），265（1H，m，H5a），301（1H，overlap，H5b），162（1H，dd，J=108，36 Hz，H6a），195（1H，m，H6b），712（1H，s，H9），640（1H，s，H12），580（1H，dd，J=90，42 Hz，H14），572（1H，d，J=90 Hz，H15），258（1H，d，J=148 Hz，H17a），265（1H，d，J=148 Hz，H17b），068（3H，t，J=72 Hz，H18），078（1H，m，H19a），094（1H，m，H19b），254（1H，s，H21），210（1H，s，H22），194（3H，s，CH3），13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1679（C2），500（C3），501（C5），441（C6），550（C7），1242（C9），1220（C10），1605（C11），958（C12），1435（C13），1242（C14），1321（C15），285（C17），75（C18），258（C19），410（C20），691（C21），295（C22），2089（C=O）。以上数据与文献报道[7]数据对比，鉴定化合物3为melodinine N。

化合物4淡黄色粉末。ESIMS m/z 3371[M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：900（1H，s，H1），310（1H，d，J=102 Hz，H3a），341（1H，ddd，J=102，48，15 Hz，H3b），265（1H，s，H5a），301（1H，t，J=78 Hz，H5b），167（1H，dd，J=114，36 Hz，H6a），298（1H，m，overlap，H6b），665（1H，d，J=24 Hz，H9），668（1H，dd，J=78，24 Hz，H11），690（1H，d，J=78 Hz，H12），570（1H，ddd，J=15，48，96 Hz，H14），573（1H，d，J=96 Hz，H15），240（1H，d，J=150 Hz，H17a），254（1H，d，J=15 Hz，H17b），068（1H，t，J=78 Hz，H18），086（1H，m，H19a），098（1H，m，H19b），268（1H，s，H21），360（3H，s，OOCCH3），3CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1665（C2），507（C3），509（C5），442（C6），554（C7），1410（C8），1109（C9），1521（C10），1142（C11），108（C12），1370（C13），1248（C14），1327（C15），901（C16），295（C17），78（C18），264（C19），430（C20），705（C21），1674（OOCCH3），501（OOCCH3）。以上数据与文献报道[7]数据对比，鉴定化合物 4为melodinine P。

化合物5淡黄色粉末。ESIMS m/z 3672[M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：782（1H，s，H1），324（1H，m，H3），308（1H，dd，J=55，130 Hz，H5a），320（1H，m，H5b），200（1H，m，H6a），250（1H，m，H6b），745（1H，d，J=78 Hz，H9），710（1H，t，J=78 Hz，H10），719（1H，t，J=78 Hz，H11），684（1H，d，J=78 Hz，H12），595（1H，dd，J=36，102Hz，H14），602（1H，d，J=102 Hz，H15），254（1H，d，J=138 Hz，H17a），335（1H，d，J=138 Hz，H17b），220（1H，s，H18），418（1H，s，H21），555（3H，s，OOCCH3），3CNMR（CDCl3，125 MHz） δ：1671（C2），473（C3），525（C5），362（C6），596（C7），1280（C8），1265（C9），1235（C10），1270（C11），1150（C12），1343（C13），1277（C14），1269（C15），622（C16），418（C17），244（C18），2058（C19），554（C20），740（C21），1692（OCH3），531（OCH3）。以上數据与文献报道[8]数据对比，鉴定化合物5为melodinine T。

化合物6淡黄色粉末。ESIMS m/z 3213[M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz） δ：790（1H，s，H1），378（1H，d，J=186 Hz，H3a），340（1H，dd，J=30，186 Hz，H3b），325（1H，dd，J=12，90Hz，H5a），310（1H，dd，J=78，90 Hz，H5b），230～205（5H，m，H6，17，19），717（1H，d，J=75 Hz，H9），702（1H，t，J=75，78 Hz，H10），719（1H，t，J=75，78Hz，H11），594～591（2H，m，H14，15），092（1H，d，J=72 Hz，H18），360（1H，s，H21） 192 （3H，s，CH3）。13CNMR （CDCl3，125 MHz） δ：1688（C2），472（C3），545（C5），380（C6），569（C7），1307（C8），1241（C9），1240（C10），1283（C11），1165（C12），1376（C13），1259（C14），1269（C15），678（C16），386（C17），87（C18），525（C19），458（C20），619（C21），2094（C=O）。以上数据与文献报道[9]数据对比，鉴定化合物6为19epimeloscandonine。

化合物7淡黄色粉末。ESIMS m/z 3532[M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz） δ：416（1H，dd，J=48，18 Hz，H3a），343（1H，d，J=174 Hz，H3b），380（1H，m，H5a），325（1H，dd，J=102，174 Hz，H5b），214（1H，dd，J=66，156 Hz，H6a），195（1H，m，H6b），732（1H，d，J=72 Hz，H9），681（1H，d，J=78 Hz，H10），706（1H，t，J=72，78 Hz，H11），675（1H，d，J=72 Hz，H12），587（1H，m，H14），629（1H，dd，J=30，96 Hz，H15），295（1H，d，J=15 Hz，H17a），160（1H，d，J=15 Hz，H17b），062（1H，d，J=72 Hz，H18），295（1H，q，J=72 Hz，H19），290（1H，s，H21），378（3H，s，OCH3）。13CNMR（CDCl3，125 MHz） δ：490（C3），568（C5），414（C6），580（C7），1366（C8），1230（C9），1215（C10），1283（C11），1118（C12），1484（C13），1279 （C14），1315（C15），840（C16），364（C17），97（C18），510（C19），448（C20），721（C21），1725（COOCH3）。以上数据与文献报道[9]数据对比，鉴定化合物7为16hydroxy19Svindolinine。

4肿瘤细胞毒活性测试

采用MTT法，测试了化合物1～7在不同浓度下对肿瘤细胞株肺癌A549，前列腺癌PC3，胃癌HGC27 和白血病细胞HL60的抑制活性。实验具体操作参照文献方法[10]进行，结果见表1。发现化合物1～7均表現出一定的体外细胞毒活性。

鲁兖等：龙州山橙的生物碱类成分研究

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[责任编辑丁广治]

[收稿日期]20161108

[通信作者]*虞和永，主任药师，主要从事医院药学工作，Tel：（0579）89935396，Email：yuhy@zjueducn