雷公藤属植物物种间的化学成分差异性研究

陈一龙+刘翔+瞿显友+姚媛媛+励娜+梁旭明+张渝渝+杨大坚+张小梅

[摘要]以主成分分析（PCA）和方差分析法（ANOVA）研究雷公藤属植物化学成分的含量与物种相关性，并比较3个物种间的差异。采用PF6离子液体超声辅助萃取，HPLC法测定28批雷公藤属植物中雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤醌A、雷公藤甲素、雷公藤红素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素和没食子儿茶素11个成分的含量，并进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）和方差分析（ANOVA）。结果显示，雷公藤属植物3个物种中11个化学成分的含量测定结果在PCA和PLS分析结果中分别聚集在3个区域，其中雷公藤醌A是影响3个物种分别聚集的最大因素；而且11个化学成分的含量在3个物种间有显著性差异（P<0000 1），表明化学成分与物种的分类有一定的相关性，3个物种间化学成分含量差异明显。该实验含量测定方法快速准确，分析方法简单方便，为雷公藤属植物的物种分类、药效和毒性研究等提供参考。

[关键词]雷公藤属； 化学成分； 含量测定； 主成分分析； 偏最小二乘法； 方差分析； 差异性

Studies on difference of chemical compositions in plant

species of Tripterygium genus

CHEN Yilong， LIU Xiang， QU Xianyou， YAO Yuanyuan， LI Na， LIANG Xuming，

ZHANG Yuyu， YANG Dajian*， ZHANG Xiaomei*

（Chongqing Academy of Chinese Traditional Materia Medica， Chongqing 400065， China）

[Abstract]We studied the content of chemical compositions and correlation among species of Tripterygium genus by principal component analysis（PCA） and variance analysis（ANOVA）， and we also studied the difference among the 3 speciesUsing PF6 ionic liquidbased ultrasonicassisted extraction， we determined the contents of 11 compounds including wilforgine， wilforzine， triptophenolide， wilforine， triptoquinone A， triptolide， tripterin， egallocatechin， epigallocatechin， catechin， and epicatechin in 28 batches of the Tripterygium species by HPLC and PCA Partial least squares analysis （PLS） and ANOVA were also performed to verify the resultsThe analysis results of PCA and PLS showed that three species of Tripterygium genus were clustered into three regions respectively， and triptoquinone A was the important factor which affected the aggregation of these three speciesThere was a significant difference among the contents of 11 chemical components in the three species（P<0000 1）These results indicated that there was a certain correlation between the chemical compositions and the classification of the species， and the difference of the chemical compositions among the three species was obvious In this work， the content determination method is rapid and accurate， and the analysis method is simple and convenient， which provides a reference for the classification， the efficacy and the toxicity of the species

[Key words]Tripterygium genus plants； chemical compositions； content determination； principal component analysis； partial least squares analysis； variance analysis； difference

雷公藤屬植物系卫矛科植物，中国雷公藤全属有3个种雷公藤Tripterygium wilfordii Hook、昆明山海棠T hypoglaucum（Levl） Hutch和东北雷公藤T regelii Sprague et Takeda 3个物种[1]，作为传统中药材，有着悠久的沿用历史，具有祛风除湿，活血通络，消肿止痛等功效，广泛用于类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病。该属植物在分类学上一直存在一定的争议，修订版《Flora of China》将上述3个种合并为雷公藤T wilfordii [2]，刘万水等[3]通过RAPD分析发现雷公藤与昆明山海棠的种间界限模糊，Sue KaYee[4]通过 ITS 和 5S rDNA序列表明雷公藤与昆明山海棠区分不明显；刘超[56]发现雷公藤和昆明山海棠根和叶的代谢产物差异显著，呈地方区域性不同。而在毒性研究[78]结果中同样差异显著，表明其药效物质基础有一定的差异。

雷公藤属植物的药效物质基础研究主要集中在生物碱和萜类，黄酮类研究较少。本文采用离子液体超声辅助HPLC法同时测定28个产地雷公藤属植物中黄酮类成分没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素的含量，测定生物碱、萜类和内酯类成分雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤醌A、雷公藤甲素和雷公藤红素的含量，并通过PCA，PLS和方差分析等方法分析雷公藤属植物3个物种化学成分上的差异，以期在化学成分方面为雷公藤属植物的分类、研究和临床应用等提供依据。

1材料

岛津HPLC LC30A高效液相色谱仪，AEG45SM电子天平（1/10万，日本岛津公司），BP121S（1/1万）[ 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 ]。KQ250DB型数控超声波清洗器（功率250 W，频率40 kHz，巩义市予华仪器有限公司），BJ100多功能粉碎机（德清拜杰电器有限公司），HHS24恒温水浴锅水浴锅（金坛梅香仪器有限公司）；没食子儿茶素（批号FY10540924），表没食子儿茶素（批号FY10510801），儿茶素（批号FY10480928），纯度≥980%，均由成都普菲德生物科技有限公司提供，表儿茶素（批号14082007），雷公藤红素（批号14000508），雷公藤甲素（批号14110509），纯度≥980%，均由南京景竹生物科技有限公司提供。1丁基3甲基咪唑溴盐（Br，纯度≥99%），1丁基3甲基咪唑四氟硼酸盐（BF4，纯度≥99%），1丁基3甲基咪唑六氟磷酸盐（PF6，纯度≥99%），1己基3甲基咪唑四氟硼酸盐（[HMIm]BF4，纯度≥99%），1己基3甲基咪唑六氟磷酸盐（[HMIm]PF4，纯度≥99%），1辛基3甲基咪唑四氟硼酸盐（[OMIm]BF4，纯度≥99%），均由中科院兰州化学物理研究所提供。乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯（重庆川东化工集团化学试剂厂）。

本实验所用药材由重庆市中药院生药研究所野外采集，经重庆市中药研究院瞿显友研究员鉴定为雷公藤T wilfordii、昆明山海棠T hypoglaucum和东北雷公藤T regelii 的干燥根。

2方法与结果

21色谱条件的建立色谱柱Inertsil ODS4（46 mm×250 mm，3 μm）；流动相乙腈（A）01%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～35 min，8%～10% A；35～47 min，10%～20% A；47～60 min，20% A；60～65 min，20%～10% A）；检测波长210 nm；柱温30 ℃；流速075 mL·min-1；进样量10 μL；对照品、样品及空白样品色谱图（没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素），见图1。

色谱柱Inertsil ODS4（46 mm×250 mm，3 μm）；流动相乙腈1%磷酸水溶液（30∶70）洗脱，流速075 mL·min-1；检测波长220 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。雷公藤甲素对照品、样品及空白样品色谱图（雷公藤甲素），见图2。

陈一龙等：雷公藤属植物物种间的化学成分差异性研究

本文中雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤醌A和雷公藤红素的含量采用离子液体超声辅助HPLC测定[911]。

22对照品溶液的制备分别精密称取没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素适量，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得，含没食子儿茶素对照品0010 7 g·L-1、表没食子儿茶素对照品0023 0 g·L-1、儿茶素对照品0005 8 g·L-1和表儿茶素对照品0021 4 g·L-1的混合溶液；精密称取雷公藤甲素适量，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得含甲素0064 4 g· L-1的对照品溶液。

23供试品溶液的制备取昆明山海棠粉末（过3号筛）05 g，精密称定，置于具塞离心试管中，精密加入06 mol·L-1 PF6乙酸乙酯溶液2 mL，超声萃取30 min，乙酸乙酯补足初重，离心5 min（12 000 r·min-1），上清液微孔滤膜滤过，即得（没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素和雷公藤甲素）。

24线性关系的考察分别精密吸取混合对照品溶液1，5，8，10，15，20，25 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积[1214]。分别以没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素的含量（μg）为横坐标（X）、峰面积积分值为纵坐标（Y），进行回归，同时测定各待测物的定量限（S/N=10）和检测限（S/N=3），回归方程及线性关系见表1（没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素）。

分别精密吸取雷公藤甲素对照品溶液1，5，8，10，15，20，25 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。以雷公藤甲素的含量（μg）为横坐标（X）、峰面积积分值为纵坐标（Y），进行线性回归，同时测定待测物的定量限（S/N=10）和检测限（S/N=3），得到回归方程及线性关系见表1（雷公藤甲素）。

25精密度试验精密吸取同一没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素混合对照品溶液，雷公藤甲素对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积，计算RSD。没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素和雷公藤甲素的RSD依次为070%，14%，14%，16%，040%，表明仪器具有较好的精密度。

26稳定性试验精密吸取对照品溶液和重复性考察项下的样品溶液各10 μL，分别在0，2，4，8，12，24，48 h进样，测定峰面积，计算RSD。结果，对照

品中没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素和雷公藤甲素的RSD依次为25%，23%，12%，23%，097%；样品中没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表兒茶素和雷公藤甲素含量的RSD依次为29%，15%，30%，19%，14%，表明对照品溶液和供试品溶液在48 h内稳定性良好。

27重复性试验按拟定方法制备样品，取样品约05 g，共12份（6份1组，共2组），精密称定，按拟定测定方法测定峰面积，计算含量和RSD，结果没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素和雷公藤甲素的RSD依次为12%，14%，18%，14%，22%，6份样品测定值的相对标准偏差低于3%，表明本法具有较好的重复性。

28加样回收率试验取昆明山海棠粉末（约025 g/份），精密称定，精密加入没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素和雷公藤甲素混合对照品溶液适量（3种不同水平，各3份），分别加入含量相当量的50%，100%，150%，测定含量，计算回收率，没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素和雷公藤甲素的平均回收率分别为1008%，1002%，1000%，9962%，1005%；RSD分别为19%，22%，20%，11%，19%。

29供试品含量测定按23项下的制备方法制备供试溶液，按21项下的色谱条件进样，测定峰面积，计算含量，以及雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤醌A和雷公藤红素含量[911]见表2。

210统计学分析雷公藤属3个物种化学成分含

量数据导入Graphpad Prism进行数据处理并方差分析见表3。结果显示，11个化学成分含量在物种上有显著性差异，P<0000 1。单个成分东北雷公藤与雷公藤的雷公藤晋碱、雷公藤醌A和雷公藤红素单个成分含量有显著性差异，P<0005；东北雷公藤与昆明山海棠的雷公藤红素和表儿茶素单个成分含量有显著性差异，P<0005见图3。

211化学模式识别法分析雷公藤属3个物种化

学成分含量主成分分析得分图显示见图4，前2个主成分贡献率为60%（PC1=36%，PC2=24%），3个品种聚集密集程度相似，雷公藤和东北雷公藤分别聚在一起，昆明山海棠大部分聚在一起，昆明山海棠样品V18和V19与雷公藤更接近，V6样品偏离较大，可能是该样品采集地海拔明显高于其他产地的原因。

雷公藤属3个品种化学成分含量数据PLSDA分析，参数为R2X=267%，R2Y=301%，Q2=25%，昆明山海棠、雷公藤和东北雷公藤分成3个聚集区，雷公藤和东北雷公藤相对昆明山海棠聚集的更密集，昆明山海棠聚集的相对松散，见图5。载荷图显示对其分类影响最大的成分是雷公藤醌A，见图6。

3讨论

31离子液体溶液可以有效提高中药待测成分的提取率前期研究考察了离子液体的种类、离子液体浓度、固液比、分散剂、提取方式、提取时间和不同粉碎度等方法，表明加离子液体的溶液提取率高于相应的不加离子液体溶剂，其中离子液体PF6的提取效率最高。

PF6溶液提取雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤醌A和雷公藤红素6个成分比相应的单纯溶剂提取的质量分数分别高出1047%，831%，288%，1418%，111%，810%[910]。同时离子液体PF6乙酸乙酯溶液提取雷公藤甲素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素5个成分的含量比单纯用乙酸乙酯提取分别高570%，430%，670%，830%，420%[11]见表4。采用离子液体结合超声波提取法可以有效的提取昆明山海棠中11种活性成分，该方法稳定、简单、绿色环保。

32化学模式识别法和统计分析雷公藤属植物的差异PCA得分图中雷公藤属植物3个物种分布在3个区域，PLS载荷图显示雷公藤醌A为影响3个物种聚类的最大因素。这与方差分析结果相同，说明雷公藤属植物在11个成分方面有一定差异。

昆明山海棠样品中除了V6偏离太远，V1～13样品聚集在一个范围，其产地为四川、贵州与云南；V14～17号样品聚集在另一个范围，产地为湖南重庆。样品V18 和V19与典型的雷公藤更接近，典型的雷公藤和昆明山海棠样品则各自聚集在一起，呈现区域性聚集。得分图的下面部分为昆明山海棠，上面部分为雷公藤，同样呈现一个渐变的趋势，与产地从西部到东部的变化相似。

雷公藤属3个物种的含量测定结果方差分析显示雷公藤与昆明山海棠的单个成分未表现出显著性差异，但是东北雷公藤与雷公藤的雷公藤晋碱、雷公藤醌A和雷公藤红素单个成分含量差异显著，P<0005，东北雷公藤与昆明山海棠的雷公藤红素和表儿茶素单个成分含量差异显著，P<0005。这与文献报道的东北雷公藤可以作为一个独立的物种，雷公藤和昆明山海棠之间的区分不明显结果一致。而11个成分则在雷公藤属植物中有显著性差异，P<0000 1，说明雷公藤3个物种中单一成分无明显差异，但物种间化学成分整体上有显著差异。

33雷公藤属植物分类学争议雷公藤属植物在分类学上一直存在争议，《中国植物志》的中英文版分别将该属植物分为了3个种和1个种。文献报道[34，15]显示，从遗传分类角度分析，存在大量的中间类型，使种间界限模糊；化学角度分析发现根和叶的代谢产物差异显著[56]；毒性角度分析[78]发现昆明山海棠乙醇提取液的毒性小于雷公藤乙醇提取液。昆明山海棠和雷公藤乙醇提取液的LD50分别为3484，1631 g·kg-1，毒性差异较大，同时有文献报道毒性成分即为有效成分[16]，这就导致在药用生产时，若两者混用，药材来源为昆明山海棠，以雷公藤入药会造成毒性过大，增加安全隐患，相反，药材来源为雷公藤，以昆明山海棠入药则可能使耐用雷公藤制剂的患者治疗的疗效降低甚至无效[17]。

雷公藤与昆明山海棠的形态变异具有连续性，存在大量的中间类型，连接了这2个种物，导致种间界限模糊，但雷公藤与昆明山海棠作为药用植物，其药效物质基础有一定差异，其毒性差异较大，而东北雷公藤尚无药用历史，从药用历史、临床不良反應和临床的产品应用上，为保证临床上雷公藤类制剂的安全有效，建议3个种在药用基源上分列3个种。

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[责任编辑丁广治]

[收稿日期]20160720

[基金项目]重庆市集成示范计划（重大）项目（cstc2013jcsf10011）；重庆市科委应用开发计划（重大）项目（cstc2014yykfC10005）；重庆市青年科技人才培养计划项目（cstc2014kjrcqnrc10006）；重庆市卫生和计划生育委员会中医药科技项目（zy201601011）

[通信作者]*杨大坚，博士，研究员，主要从事中药品种及品质研究工作，Tel：（028）89029081，Email：yangdajian@foxmailcom； *张小梅，博士，副研究员，主要从事中药新药开发及物质基础研究工作，Email：605050963@qqcom