胃癌细胞中miR-455-3p的表达及其对增殖和凋亡的影响

夏茜，李晖，吴杰

（华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院 消化内科，湖北 武汉430000）

胃癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其致死率高居癌症相关死因的第2位[1]。我国是胃癌高发区，发病率高居所有恶性肿瘤之首，死于胃癌的人数约占所有肿瘤致死人数的25%[2]。尽管近年来胃癌的治疗取得了很大进步，但胃癌的总体预后仍不理想。miRNA是一类内源性的非编码RNA，其长度大约在20个核苷酸，通过与3'端或5'端的非翻译区结合对mRNA进行调控，影响编码蛋白的表达，进而调节着细胞增殖等过程[2-5]。许多研究[6-9]表明肿瘤的发生与miRNA的异常表达密切相关。miR-455-3p被报道在结肠癌、食管癌及乳腺癌中参与调控增殖、凋亡、侵袭及转移等肿瘤生物学过程[10-12]。然而目前尚无关于miR-455-3p在胃癌细胞系中的表达及对胃癌增殖和凋亡的影响的报道，本研究旨在探讨miR-455-3p在胃癌中的表达情况及对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1及5种胃癌细胞系（AGS、Hs746T、MGC-803、SGC-7901、BSG-823）均购自武汉大学医学实验中心，DMEM培养基、TRIzol均购自美国Invitrogen公司，caspase-3、caspase-8、caspase-9活性检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司，p27 kip1蛋白、p21及GAPDH一抗均购自美国Santa Cruze公司，实验所需的二抗购自美国BD公司，miR-455-3P模拟物及阴性对照序列均由上海吉玛生物科技有限公司合成。

1.2 细胞培养分组及转染

正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1及5种胃癌细胞系均加入至DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。利用lipofectamine 2000分别将AGS细胞系转染miR-455-3p模拟物和miR-455-3p阴性对照序列，miR-455-3p模拟物序列引物的正义链为：5'-GCA GUC CAU GGG CAU AUA CAC-3'，反义链为：5'-GUG UAU AUG CCC AUG GAC UGC UU-3'；阴性对照序列为随机序列，正义链为：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'，反义链为：5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'，转染浓度为300 nmol/mL孔，将两组细胞培养24 h后行后续实验。

1.3 RNA 提取与 qRT-PCR

按TRIzol reagent说明书从miR-455-3p模拟物组和阴性对照组细胞中提取总RNA，并采用NanoDrop1000分光光度计（美国Thermo Scientific公司）测定RNA浓度，利用荧光定量PCR系统（美国Applied Biosystems）测定。所采用的引物序列如下：miR-455-3p序列（PUBMED号：MIMAT0004784）：5'-GCA GUC CAU GGG CAU AUA CAC-3'，使用2-ΔΔCt方法定量，内参选择为U6小核RNA，并计算miR-455-3p的相对表达量。

1.4 细胞增殖能力检测

采用CCK8法，将miR-455-3p模拟物组与阴性对照组两组细胞消化成单细胞悬液，以2×103个/孔将两组细胞种植于96孔板上，每孔培养基体积200 µL，经分别培养0、1、2、3、4 d后，每孔加入20 µL CCK-8溶液，继续培养1 h后，在450 nm波长下，用酶标仪测定各孔吸光值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.5 细胞凋亡检测

采用流式细胞术，用Annexin V/PI 染色检测，将miR-455-3p模拟物组和阴性对照组两组细胞消化成单细胞悬液后，PBS清洗2次，并使用结合缓冲液重悬，加入相应比例的Annexin V抗体，避光染色10 min后加入适量PBS溶液以及PI染料，流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞比例来确定细胞凋亡的变化。

1.6 蛋白表达检测

采用Western blot法测定p27 kip1和p21蛋白的表达量，培养24 h后，收集miR-455-3p模拟物组和阴性对照组细胞，裂解后，提取总蛋白，以每孔20 μg蛋白量上样，浓缩胶100 V 30 min，分离胶60 V 1 h，转膜，加入p27 kip1和p21一抗，浓度为1:200，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗，加入二抗，浓度为1:1 000，显影液曝光，以GAPDH为内参，测定条带灰度值，实验重复3次，取平均值，以目的蛋白测定值与GAPDH的比值作为目标蛋白的相对表达量。

1.7 caspase 酶活性检测

依据caspase活性检测试剂盒说明书，将miR-455-3p模拟物组和阴性对照组细胞消化成单细胞悬液，1 000r/min低速离心5 min，收集2×103个细胞，裂解细胞，分别加入caspase酶活性检测试剂盒，在405 nm下用分光光度计测量两组吸光度。

1.8 统计学处理

统计学处理采用SPSS 20.0软件分析，用均数±标准差（）表示计量资料，采用t检验行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-455-3p在胃癌细胞系中的表达情况

qRT-PCR示：miR-455-3p在胃癌细胞系AGS中相对表达量为0.10±0.03，Hs746T中为0.45±0.04，MGC-803中为0.25±0.03，SGC7901中为0.30±0.07，BSG823为0.26±0.03，正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1相对表达量为1.0±0.03，miR-455-3p在5种胃癌细胞系中的相对表达量明显低于RGM-1细胞系（均P＜0.05）（图1）。

图1 miR-455-3p在胃癌细胞系及正常胃黏膜上皮细胞系中的表达 与RGM-1细胞比较，1）P＜0.01；2）P＜0.001Figure 1 Expressions of miR-455-3p in normal gastric mucous cell line and different types of gastric cancer cell lines 1) P＜0.01;2) P＜0.001 vs. RGM-1 cells

2.2 miR-455-3p过表达对胃癌细胞增殖的影响

miR-455-3p模拟物组与阴性对照组比较，在转染后0、1、2、3、4 d的OD 450 nm值分别为[（0.29±0.03）vs.（0.27±0.04），P＞0.05]，[（0.43±0.08）vs.（0.75±0.10），P＜0.05]，[（0.69±0.09vs.（1.57±0.25），P＜0.05]，[（1.13±0.15）vs.（2.23±0.19），P＜0.01]，[（1.72±0.20）vs.（3.48±0.27），P＜0.001]（图2）。

图2 miR-455-3p模拟物组和阴性对照组增殖曲线的比较与阴性对照比较，1）P＜0.05；2）P＜0.01；3）P＜0.001Figure 2 Comparison of the proliferation curves of miR-455-3p mimics group and negative control group 1) P＜0.05;2) P＜0.01;3) P＜0.001 vs. negative control group

2.3 miR-455-3p过表达对胃癌细胞凋亡的影响

转染48 h后，流式细胞术示，miR-455-3p模拟物组细胞凋亡率为（21.33±1.20）%，阴性对照组为（1.46±0.14）%，miR-455-3p模拟物组细胞凋亡率明显高于阴性对照组（P＜0.001）（图3）。

图3 miR-455-3p模拟物组和阴性对照组凋亡情况比较 A：流式细胞术示两组的凋亡情况；B：两组凋亡率比较Figure 3 Comparison of apoptosis of miR-455-3p mimics group and negative control group A:Apoptosis examined by flow cytometer;B:Comparison of the apoptosis rates between the two groups

2.4 miR-455-3p 过表达对 p27 kip1 和 p21 蛋白表达的影响

Western blot检测细胞周期相关蛋白p27 kip1和p21蛋白，发现miR-455-3p模拟物组p27 kip1表达量明显高于阴性对照组[（3.1±0.27）vs.1.0，P＜0.01]；miR-455-3p模拟物组p21表达量与阴性对照组差异无统计学意义[（1.1±0.05）vs.1.0，P＞0.05]（图4）。

图4 miR-455-3p模拟物组与阴性对照组P27 kip1与P21表达情况Figure 4 Protein expressions of P27 kip1 and P21 in miR-455-3p mimics group and negative control group

2.5 miR-455-3p过表达对caspase蛋白活性的影响

以阴性对照组为参照，miR-455-3p模拟物组caspase-8相对活性为0.95±0.07、caspase-9相对活性为2.1±0.15、caspase-3相对活性为3.4±0.3，后两项差异有统计学意义（均P＜0.05）（图5）。

图5 miR-455-3p模拟物组与阴性对照组caspase酶活性比较Figure 5 Comparison of activities of caspase enzymes of miR-455-3p mimics group and negative control group

3 讨 论

胃癌的发生及发展是受到包括miRNA在内的众多基因参与及调控的结果[13]。miRNA已成为胃癌研究领域的热点，其在胃癌的发生发展中可起促癌或者抑癌作用[13]。Zhang等[14]报道miR-21在人胃癌细胞及组织中表达增加，且miR-21高表达能显著促进人胃癌细胞株增殖与侵袭能力。Katada等[15]分析了42 个未分化胃癌及邻近正常胃组织的miRNA表达谱，发现miR-34b、miR-34c、miR-128a、miR-20b及miR-150在未分化胃癌中的表达水平显著升高，且miR-20b 及miR-150高表达的患者生存率低，反之在未分化胃癌中miR-128b、miR-129 及miR-148 表达水平明显下调；miR-27a的表达水平与淋巴结转移显著相关。Motoyama等[16]发现let-7家族的表达水平与高迁移率族蛋白A2呈负相关，且是影响胃癌预后的独立因子。Tie等[17]证实了miR-218与Robo1蛋白的表达负相关，miR-218低表达可激活Robo1-Slit通路并诱发肿瘤转移，而过表达的miR-218在体外可抑制肿瘤细胞侵袭，并认为miR-218可作为胃癌靶向治疗的候选基因。Guo等[18]发现过表达miR-331-3p可以调控靶基因转录因子E2F1进而抑制肿瘤细胞增殖。

在结肠癌细胞系中，过表达miR-455-3p可抑制细胞增殖，并诱导凋亡，起抑癌基因的作用[10]。在三阴性乳腺癌中，过表达miR-455-3p通过靶向作用于抑癌基因EI24，而促进迁移和侵袭[11]。在食管鳞癌中，miR-455-3p通过靶向FAM83F抑制细胞增殖和侵袭[12]。本文研究了miR-455-3p对胃癌增殖的影响，并初步探寻了其机制，相对于正常胃细胞系，miR-455-3p在5种胃癌细胞系中的表达量均显著地下调；miR-455-3p的过表达能够显著抑制胃癌细胞系AGS的增殖，这表明miR-455-3p可能在胃癌细胞中发挥着抑癌基因的作用。

p27 kip1是一种热稳定蛋白，又称激酶抑制蛋白1（kip1），是能够结合细胞周期蛋白-周期素依赖激酶2复合体的一种多肽分子，p27 kip1与肿瘤的发生及发展关系密切，具有负性调节细胞增殖能力的作用，许多研究[19-24]证实p27 kip1的表达水平随着肿瘤恶性程度的增高而降低。通过发挥细胞周期的负性调控作用，p27 kip1抑制细胞周期素E、D等G1期激酶复合物，阻止细胞从G1期进入S期，防止细胞出现异常增殖和分化；当 p27 kip1表达水平下降时，这种细胞周期阻滞作用便会减弱，导致细胞出现异常增殖和分化，促进肿瘤生成、浸润及进展[20-21]。本研究进一步通过Western blot检测了miR-455-3p模拟物组和阴性对照组p27 KIP1和p21蛋白的相对表达量，发现miR-455-3p模拟物组p27 kip1表达量显著高于阴性对照组，这与miR-455-3p模拟物组抑制增殖的作用相一致，可能通过抑制细胞周期素E、D等G1期激酶复合物，阻止细胞从G1期进入S期[20-21]。而p21在两组间表达差异无统计学意义。

进一步，本研究发现过表达m i R-4 5 5-3 p能促进胃癌细胞系A G S的凋亡，并显著增加caspase-9、caspase-3的活力，这说明miR-455-3p的表达上调可能通过增加caspase-9、caspase-3的活力而促进胃癌细胞凋亡，而miR-455-3p表达上调对于p21蛋白的水平及caspase-8活力影响不大。caspase-3是细胞凋亡途径中的重要调控因子，caspase-9、caspase-3均为内源性途径(线粒体途径)凋亡的重要组成部分。作为caspase系统下游的重要成员，caspase-3的激活是bax诱导的细胞凋亡所必需的步骤，并且caspase-3与Bcl-2、Bax等关系密切并相互作用调控细胞凋亡[25]。黄斌等[25]研究发现靶向治疗后的胃癌组织caspase-3水平明显上调，并且与正常组织相比较，胃癌细胞及组织的caspase-3水平明显下调，这说明caspase-3水平与肿瘤恶性程度可能呈负相关。本研究结论与黄斌等[25]的结果一致，说明了miR-455-3p可能通过上调caspase-9、caspase-3的表达水平进而促进胃癌细胞凋亡。同时我们的结果也表明了miR-455-3p有望成为胃癌治疗的新靶点及突破口。

当然，本研究也存在一些不足之处，比如miR-455-3p的下游靶基因尚需要通过双荧光素酶实验验证，miR-455-3p在动物体内的作用如何也需要进一步研究。

总之，本研究证明了miR-455-3p在胃癌细胞中呈低表达水平，miR-455-3p表达上调能够通过上调p27 kip1表达水平抑制胃癌细胞增殖并通过上调caspase-9、caspase-3的表达水平而促进胃癌细胞凋亡，这为深入揭示胃癌的发病机制提供了新的视点，且可能作为一个新的治疗靶点。

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