光动力学疗法对瘢痕成纤维细胞中转化生长因子β1的作用

蔡 宏，王毅侠，李 铀，刘 玮，孙 平，董 宁

光动力学疗法对瘢痕成纤维细胞中转化生长因子β1的作用

蔡 宏1，王毅侠1，李 铀1，刘 玮1，孙 平1，董 宁2

(1.解放军空军总医院皮肤科 北京 100142; 2.解放军总医院第一附属医院烧伤研究所 北京 100037 )

目的：探讨光动力学疗法（Photodynamic therapy, PDT）对体外培养瘢痕成纤维细胞（hypertrophic scar fibroblast，HSF）中转化生长因子β1的影响。方法：将原代培养的HSF分为对照组、HMME-PDT组、单纯光敏剂组和单纯激光照射组，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测PDT后HSF分泌至上清液的TGF-β1蛋白表达量，应用Western-Blot观察PDT对细胞浆内转化生长因子β1的作用。结果：HSF分泌至细胞上清液的TGF-β1蛋白含量较高，而HMME-PDT后降低；HSF合成的TGF-β1蛋白水平高，HMME-PDT后HSF中的TGF-β1蛋白含量减少。结论：HMME-PDT能够阻止TGF-β1的信号传向细胞核，改变TGF-β1在HSF细胞水平的表达，使细胞核内细胞增殖及胶原合成有关的靶基因得不到激活，从而抑制HSF增殖。

光动力学疗法；激光；光敏剂；瘢痕成纤维细胞；转化生长因子β1

血卟啉单甲醚（Hematoporphyrin Monomethyl Ether, HMME）－光动力学疗法（Photodynamic therapy, PDT）可以抑制体外培养HSF的增殖，但是，对于该作用机制尚未阐明。HSF作为创伤修复过程中重要的功能细胞和HS组织中主要的细胞成分，其分泌的多种细胞因子对HS的形成和发展有着重要影响。

目前的研究表明，创伤愈合过程中，生长因子的持续刺激作用是导致HS形成的重要原因[1]。转化生长因子β（transforming growth factor-beta, TGF-β）具有调节细胞增殖、促进细胞外基质的产生、调控细胞的粘附和游走性等功能，它在创伤愈合过程中的效应取决于自身特性、浓度、靶细胞的种类和特性等。在TGF-β超家族中，TGF-β1是与瘢痕过度形成关系最为密切的细胞因子[2]。虽然TGF-β1对成纤维细胞的影响可能是正向的，也可能是负向的，但就总体而言，特别是从大量实验研究和临床实践表明，TGF-β1是促进HS发生的重要因子。本研究检测了HSF在经过HMME-PDT照射后TGF-β1蛋白的表达情况，并探讨了其与HSF增殖的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验标本来源：本实验所有标本均取自解放军总医院第一附属医院烧伤整形科的HS患者，取材经患者本人同意，HS患者共10例，男8例，女2例，年龄15～25岁，病变部位为前胸、背部，均处于增生期，此前未接受过其它治疗，均经临床及病理证实诊断。

1.1.2 实验试剂和仪器：HMME（上海第二军医大学研制，批号031209）；人转化生长因子定量酶联检测试剂盒（上海森雄科技公司）；TGFβ1单克隆抗体、FITC标记羊抗鼠/兔IgG（北京中杉金桥生物技术公司）；蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司）；630nm半导体红光激光器（桂林兴达光电医疗器械有限公司）；LM－93II型激光功率计（中国计量院）；Olympus-BH2型生物显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代培养：将手术切除的瘢痕组织，在无菌条件下剪成0.5～1.0cm3的小块，立即投入含100U/ml青、链霉素的培养液中。剪除脂肪、表皮及结缔组织，D-Hanks液清洗至无油滴，反复剪碎至小于1mm3的小块，按适当间隔接种于培养瓶壁上，反转使有组织块的一面向上，加入含15%FBS的F12/DMEM培养基3ml，置37℃、5% CO2孵箱中孵育4h后，轻轻倒转，使培养液浸没组织块，待培养液变黄后更换。4～10d组织块周围萌出细胞并逐渐形成细胞晕，20～30d细胞长满瓶，形成细胞单层。

1.2.2 传代培养：用0.25%胰酶消化，吹打，制成单细胞悬液。按1∶2比例传代，建立HSF的传代细胞系，实验用第4～6代细胞，待细胞70%～80%融合时用于后续实验。

1.2.3 PDT处理和实验分组：培养的HSF与4μg/ml的HMME避光孵育4h后行PDT处理。照射波长为630nm，调整功率密度至10mW/cm2，能量密度2.5J/cm2；照光前后均监测输出功率，输出功率波动范围＜±5%；PDT后继续将细胞放回孵箱中孵育20h，再进行下一步实验检测。其中，对照组不给予光敏剂和照光处理。并设立单纯光敏剂组（PS：4μg/ml HMME）和单纯激光照射组（Laser：波长630nm，功率密度10mW/cm2，能量密度2.5J/cm2）。

1.2.4 ELISA法检测HSF分泌TGF-β1蛋白水平：检测步骤按试剂盒说明书进行，试剂盒的敏感性小于16pg/ml。建立标准曲线孔后，在待测品孔中加入已激活的标本，每组每次4孔，重复3次。将反应板置于37℃孵育120min，洗板后加入第一抗工作液，继续37℃孵育60min。洗板后加入酶标抗体工作液，37℃孵育60min，再次洗板并加入底物工作液，置37℃反应5～10min后，加入终止液终止反应，在酶联仪上492nm处测定吸光值。根据样品OD值在标准曲线上查出TGF-β1蛋白含量，并依据最初稀释比例计算TGF-β1蛋白浓度值。

1.2.5 蛋白的提取及Western-blot分析：应用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，12 000g离心15min，将上清转管后于-80℃冻存。在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，上样量为30μg总蛋白。电泳完毕后，使用电转移仪将样品转移至PVDF膜。用5%的脱脂奶粉PBS液室温封闭1h，在封闭液中分别加入兔抗人Smad3 mAb、磷酸化Smad3 mAb（1:1000）4℃过夜。TBST漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（稀释比例为1:1000）。在暗室中，采用化学发光反应试剂盒进行检测。

1.2.6 统计学方法：数据以均数±标准差(x¯±s)表示，采用Chiss软件进行统计分析，行配对t检验，P＜0.05时差异有显著意义。

2 结果

2.1 HMME-PDT对瘢痕成纤维细胞分泌TGF-β1的影响：经过5次重复实验后，得出HSF对照组中细胞分泌至培养上清中的TGF-β1蛋白为（64.56±14.46）ng/ml，即表示HSF分泌至细胞外的TGF-β1蛋白含量较高。HMME-PDT治疗组为（23.94±8.55）ng/ml，与对照组相比，其分泌量显著降低，二者相比具有统计学差异（P＜0.05）（见图1）。

图1 HMME-PDT对瘢痕成纤维细胞分泌TGF-β1的影响（n=12）

2.2 HMME-PDT对HSF中TGF-β1的影响：与对照组相比，Western-blot结果表明HMME-PDT治疗后HSF中TGF-β1蛋白含量减少（0.97±0.12 VS 0.28±0.02, P＜0.05），PS组和Laser组中TGF-β1蛋白表达无显著改变（0.97±0.12 VS 0.82±0.14, P＞0.05；0.97±0.12 VS 0.86±0.17, P＞0.05）。

3 讨论

HS是外伤、烧伤、感染或其它真皮损伤所导致的以胶原等大量结缔组织基质的过度产生和沉积为特征的皮肤纤维化疾病。大量研究表明[3]，TGF-β1表达增加与瘢痕的过度形成密切相关，当TGF-β1失去调节，持续过表达就会导致皮肤及脏器的纤维化疾病，如硬皮病，肺纤维化以及HS，甚至瘢痕疙瘩等。

TGF-β1是迄今为止人们了解最多、与创伤愈合和瘢痕形成以及多种纤维化疾病关系最密切的细胞因子之一，它还是成纤维细胞和单核细胞的有效趋化剂，是影响创面愈合及HS形成的最重要的生长因子。研究表明在裸鼠皮下注射TGF-β1可致注射局部纤维化，而全身应用可致机体主要脏器（如肺、肝、肾等）纤维化[4]。硬皮病、肺纤维化及HS等纤维化疾病患者可以检测到病变部位TGF-β1表达增强，这可能是由于TGF-β1促进成纤维细胞合成ECM，抑制胶原酶和纤溶酶原激活物的表达，增加胶原酶抑制物—金属蛋白酶抑制剂（Tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）、纤溶酶原激活物抑制剂（Plasminogen Activator Inhibitor 1, PAI-1）的产生，拮抗某些细胞因子的致丝裂作用等[5]。

图2 HMME-PDT对HSF中TGF-β1/Smads信号传导蛋白的影响

本实验结果表明，HMME-PDT抑制体外培养的HSF合成并分泌TGF-β1蛋白。由于TGF-β超家族成员通过膜绑定异侧的丝氨酸/苏氨酸激酶受体复合体传递信号，所以在配体绑定后，受体激活进而导致胞质Smad家族蛋白底物磷酸化[6]。TGF-β1诱导的信号转导通路可以分为细胞外和细胞内信号转导两相，其信号转导的调控也就体现在不同的水平之上。细胞外部分，包括配体的程序性激活和可控性扩散、配体-受体复合物形成等；细胞内部分由于涉及到细胞信号网络，相对比较复杂，不仅有TGF-β1自身信号转导通路每个环节的调控，也同时存在其它信号转导通路的交叉调节，以及各个通路之间的整合或互相拮抗。因此，TGF-β1信号转导调控系统是复杂而精密的。正是由于有如此精密的调控系统的存在，才使得TGF-β1能在不同环境下发挥它的多种功能，产生各种效应。

正常成纤维细胞合成TGF-β1后并非直接分泌到细胞外发挥功能，而是与特定的蛋白质相互作用形成复合体，以较大的前体形式存在于细胞中[7]。这些蛋白质包括：LAP（Latency associated peptide, LAP）、LTBP（Latent TGF-β1binding protein）等。它们在复合体中能够帮助TGF-β1的正确折叠并保持其稳定性，并使其易于分泌。本实验采用ELISA方法检测HSF分泌到细胞外的TGF-β1水平，表明HSF分泌较多的TGF-β1，这与上述HSF的高代谢、高分泌状态相一致。

Heckenkamp等[8]在抑制静脉血管再狭窄的研究中发现，PDT治疗后第3和第7天，成纤维细胞的增殖能力分别减少了30%和76%，其所分泌的细胞外基质也分别减少了47%和51%，并推测该效应的产生与TGF-β1mRNA的表达显著降低密切相关。Gold等[9]已证实TGF-β1能够在成纤维细胞中大量表达，提示瘢痕形成涉及成纤维细胞向TGF-β1的高敏性转换和积累，并且这类高敏的成纤维细胞未能及时消亡而且仍然分泌TGF-β1形成正反馈。所以，通过各种方法下调或对抗TGF-β1是目前防治瘢痕的方向之一。

研究表明[10]HMME的主要成分为相对疏水性卟啉，易结合于细胞的内质网、高尔基体、溶酶体等膜性结构。HSF细胞内的内质网丰富，高尔基体发达，以及线粒体数目大量增加，HMME进入HSF后以这些细胞器为主要分布位点，经激光照射产生反应活性很高的自由基和单线态氧等ROS，导致亚细胞水平多位点损伤。由于蛋白合成的场所——粗面内质网和核糖体受PDT损伤，从而抑制了细胞合成与分泌TGF-β1等蛋白的能力。本实验结果亦表明HMME-PDT能够抑制HSF分泌TGF-β1，其表达水平显著降低。本实验采用ELISA的方法检测到，HMME-PDT组HSF分泌TGF-β1蛋白减少，故笔者推测正是由于HMME-PDT阻滞细胞的高增殖和高分化，导致其自身合成TGF-β1蛋白的能力下降，递呈给TβRⅠ的信息减少，进一步抑制HSF的增殖。此外，由于HMME易于在细胞膜性细胞器积聚，故推测细胞膜必然也是HMME结合和积聚的位点。经PDT治疗后必然会损伤细胞膜，分布于细胞膜上的TGF-βR功能亦受损，影响细胞外信号TGF-β1向细胞内有效传导。

HS的挛缩影响皮肤的正常外观和功能，在挛缩过程中HSF向肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）分化，它是成纤维细胞在创伤愈合或挛缩过程中的一种终极表型，Adam等在α-SMA基因启动子序列中发现了一个TGF-β1调控位点（TGF-β1Control Element，TCE），提出TGF-β1本身可以直接参与到MFB的分化，并认为除了TCE外，TGF-β1还作用于内源性的CArG[CC(A/T)6GG]控制元件调控成纤维细胞的分化。研究发现[11-12]，抗体靶向光分解(antibodytargeted photolysis, ATPL)对于体外控制FPCLs收缩是一种具有高选择性和有效的方法，通过改变光敏剂和光剂量等PDT参数，能减少FPCLs的收缩程度，为调控细胞外基质的产生提供可能。本实验的研究结果表明，HMME-PDT抑制体外培养的HSF自分泌和合成TGF-β1蛋白，终而可能会通过TCE或其它相关控制元件影响MFB的分化和α-SMA蛋白的表达，发挥抑制瘢痕挛缩的作用。

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The Investigation of Transforming Growth Factor β1in HSF after HMME-PDT

CAI Hong1,WANG Yi-xia1,LI You1,LIU Wei1,SUN Ping1,DONG Ning2
(1.Department of Dermatology, The General Hospital of Air Force, Beijing 100142, China;2. Burns Institute, the First Hospital Affiliated to the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100037,China)

ObjectiveTo investigate the response of TGF-β1after PDT which induced by hematoporphyrin monomerthyl ether (HMME) in human fibroblasts from hypertrophic scar (HSF).MethodsFibroblasts were cultured from nontreated hypertrophic scars, and cells were divided into 4 groups: control (untreated), HMME-PDT, HMME and Laser. The expression of TGF-β1in supernatant of HSF was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of TGF-β1was analyzed by Western blot.ResultsHMME-PDT down-regulated the protein level of TGF-β1both in supernatant of HSF and in HSF.ConclusionHMME-PDT decreased TGF-β1activation. It inhibited the proliferation of HSF through decreased the activation of taget gene.

Photodynamic therapy; laser; Photosensitizer; hypertrophic scar fibroblast; TGF-β1

R619+.6

A

1008-6455（2017）02-0005-04

2016-07-19

2016-11-23

编辑/张惠娟

本研究受国家自然科学基金资助（光动力学疗法作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞 TGF-β1/Smad3 信号通路的分子机制：编号81301386）

刘玮，教授，主任医师，地址：北京海淀区阜成路30号，邮编：100142；E-mail：lwei5811@126.com