正交试验法优化水松叶中总黄酮的提取工艺研究

刘特津，钟希文，张文霞，陈向英，鲍俊林

（1．广州中医药大学附属中山医院，广东 中山 528400；2．广东药科大学，广东 中山 528400）

正交试验法优化水松叶中总黄酮的提取工艺研究

刘特津1，钟希文1，张文霞1，陈向英1，鲍俊林2

（1．广州中医药大学附属中山医院，广东 中山 528400；2．广东药科大学，广东 中山 528400）

目的：采用正交试验法对水松叶中总黄酮的提取工艺进行优化。方法：运用紫外分光光度法测定水松叶的总黄酮含量，采用L9（34）正交试验法考察浸泡时间、提取时间、提取次数、固液比各因素对水松叶的总黄酮含量的影响，优化提取条件。结果：水松叶总黄酮的最佳提取工艺为浸泡时间30 min，提取时间2 h，提取2次，固液比1︰20。结论：该工艺操作简单，稳定性好，可提高水松叶中总黄酮的提取率。

水松叶；总黄酮；正交试验法；提取工艺

水松叶为杉科水松属植物水松（Glyptostrobus pensilis）的叶，又名水松毛、水松须，是我国传统中药，水松叶性寒，味苦，我国民间主要用于风湿性关节炎，高血压、皮炎等[1]。据文献报道，水松叶中含有丰富的槲皮苷等黄酮类化合物，且秋季水松叶总黄酮含量比春季水松叶高[2-3]。至目前为止，尚未见有文献报道水松叶中总黄酮提取工艺的优化研究，为了提高水松叶质量标准，本实验以水松叶中总黄酮的含量为指标，采用正交试验法优选出最佳提取工艺，旨在筛选出简单、稳定、可行的水松叶总黄酮的提取方法，为水松叶的进一步开发利用奠定基础。

1 仪器与资料

1.1 仪器

JP-300A高效多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）；JJ200型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；CRLB-15005电炉（肇庆金雅乐电器有限公司）；东方-A型直热式电热恒温干燥箱（广州东方电热干燥设备厂）；DK-8D电热恒温三孔水槽（上海跃进医疗器械有限公司）；BS224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；UV-2550分光光度计（岛津）；实验室常用玻璃仪器。

1.2 材料

水松叶由康美药业股份有限公司提供（批号：150306413），经中山市中医院鉴定为杉科水松属植物水松（Glyptostrobus pensilis）的叶；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：10080-200707）；纯化水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备取水松叶粗粉10 g，置于150 mL锥形瓶中，加石油醚100 mL，超声提取30 min，弃去石油醚液，待残渣挥干，粉末置于烘箱中105℃干燥30 min，取出，装袋，备用。取处理后的水松叶粗粉1 g，精密称定，置于150 mL锥形瓶中，加入70%乙醇20 mL，称定质量，浸泡30 min，然后加热回流2 h，保持微沸，回流结束后取出放冷，称定质量，用70%乙醇补足减少的质量，摇匀，滤过。滤渣重复提取1次，滤过，合并滤液，取续滤液4 mL，置50 mL容量瓶中，70%乙醇定容，摇匀，得水松叶供试品液。

2.1.2 对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品10 mg，70%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，摇匀，配成浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 波长的确定取供试品溶液与对照品溶液各2 mL，置于25 mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，静置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀继续静置6 min，加4%氢氧化钠溶液10 mL，再加水至刻度，摇匀，静置15 min，按紫外-可见分光光度法试验，以相应的试剂为空白，在200～600 nm波长扫描，结果，芦丁对照品溶液与水松叶供试品溶液在509 nm有最大波长吸收，故确定509 nm为检测波长，见图1。

图1 对照品与供试品波长扫描图

2.1.4 标准曲线的绘制精密量取芦丁对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，分别加水到6.0 mL。分别加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，静置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀继续静置6 min，加4%氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度，摇匀，静置15 min。在509 nm波长处测定吸光度。以浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标[4]，绘制吸光度-芦丁质量浓度的关系曲线。得标准曲线：

回归结果表明，芦丁在0.000～0.040 mg/mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验精密量取2.0 mL芦丁对照品溶液，按“2.1.4”方法操作显色，定容于25 mL容量瓶中。在509 nm波长连续测定5次吸光度。结果，RSD＝1.21%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验取供试品溶液2.0 mL，按“2.1.4”方法操作显色，定容于25 mL容量瓶中。分别在0，15，30，45，60 min时间点测定吸光度。结果，RSD＝0.86%，表明供试品溶液在1 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验取供试品溶液2.0 mL，显色，定容于25 mL容量瓶中，按“2.1.4”方法操作显色，定容于25 mL容量瓶中。重复5次。509 nm波长处测定吸光度。结果，RSD＝1.4%，表明供试品溶液重复性良好。

2.1.8 加样回收试验取水松叶供试品溶液2.0 mL，6份，每份加入2 mL芦丁对照品溶液。按“2.1.4”的方法操作显色，定容于25 mL容量瓶中。于509 nm波长处测定吸光度。计算平均回收率。结果，平均回收率为97.37%，RSD＝1.1%，表明本法加样回收率高。见表1。

表1 水松叶样品溶液加样回收率

2.2 正交试验

根据预试验结果，选定浸泡时间（A），提取时间（B），提取次数（C）和固液比（D）4个因素为考察因素，以样品中总黄酮含量为考察指标，选用L9（34）正交表进行试验。因素水平见表2，正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

由表3可知极差RB＞RC＞RA＞RD，即ABCD四个因素对水松叶总黄酮含量影响的次序为B＞C＞A＞D，即提取时间对水松叶总黄酮提取影响最大，提取次数次之，固液比影响最小。由表4可知，B因素（提取时间）与C因素（提取次数）对总黄酮的提取有显著性影响，差异有统计学意义（P＜0.05）。A因素（浸泡时间）与D因素（固液比）影响不显著。通过正交试验最终确定水松叶总黄酮最佳提取工艺为A2B3C2D2，即浸泡时间30 min，提取时间2 h，提取次数2次，固液比1︰20。

2.3 验证试验

分别精密称取3份水松叶粗粉1.0 g，按最佳工艺条件平行操作，放冷，合并提取液，过滤，取续滤液4 mL，置于50 mL容量瓶中，按“2.1.4”的方法操作显色，70%乙醇定容，测得吸光度，计算总黄酮提取率分别为1.305%，1.312%，1.314%，平均提取率为1.310%，高于正交试验中的任何一组数据，表明工艺可行合理。

表2 因素与水平

表3 正交试验结果

表4 正交试验方差分析结果

3 讨论

水松叶为叶类药材，含有较高的叶绿素等化合物，故在供试品制备时采用石油醚对其进行脱色素预处理，尽可能地减少色素对实验的干扰。由正交试验结果分析可知，四个因素对水松叶总黄酮含量影响的次序为提取时间＞提取次数＞浸泡时间＞固液比。最终确定水松叶总黄酮最佳提取工艺条件为A2B3C2D2，即浸泡时间30 min，提取时间2 h，提取次数2次，固液比1∶20。该工艺简单可行，为水松叶质量标准的制订提供了参考，亦为更有效地开发利用水松叶资源提供了依据。

[1] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版,1975:533.

[2] 向瑛,郑庆安,张灿奎,等.水松叶的黄酮化合物的研究[J].中草药,2001,32(7):588-589.

[3] 斯缨,王日韦,龚复俊,等.水松叶的总黄酮含量研究[J].武汉植物学研究,2003,21(6):547-549.

[4] 邓翀,冯改利,杨乖利,等.正交试验设计优化杜仲总黄酮提取工艺[J].中华中医药杂志,2011,26(11):2695-2697.

本文编辑：苏日力嘎

Optimization of Extraction Procedure for Total Flavonoids from Glyptostrobus Pensilis Leaves by Orthogonal Experiment

Liu Te-jin1, Zhong Xi-wen1, Zhang Wen-xia1, Chen Xiang-ying1, Bao Jun-lin2
(1.Zhongshan Hospital Affiated to Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Zhongshan 528400, China; 2.Guangdong Pharmaceutical University, Guangdong Zhongshan 528400, China)

Objective：To optimize the extraction procedure for total favonoids from Glyptostrobus pensilis leaves by orthogonal experiment.Methods：The total flavonoid content in Glyptostrobus pensilis leaves was determined by ultraviolet spectrometry, and the effects of soaking time, extraction time, extraction frequency, ratio of solid to liquid on the content were investigated by L9(34) orthogonal experiment, based on which the condition for extraction was optimized.Results：The optimal soaking time, extraction time, extraction frequency and ratio of solid to liquid were 30 min, 2 h, 2 times and 1︰20 respectively.Conclusion：The extraction procedure was simple and stable, which increased the extraction rate of total favonoids.

Glyptostrobus Pensilis Leaves; Total Flavones; Orthogonal Experiment; Extraction Procedure

R283

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.01.002

2016 - 08 - 06

中山市卫生和计划生育局医学科研项目（编号：2015J048）

刘特津，男，主管中药师。研究方向：中药炮制与鉴定。通讯作者E-mail：tejin6109@163.com