槐米中芦丁的提取工艺优化及检识

张 依 周泽纯 全锦秋 蒙兰花

1.广州医科大学药学院，广东广州 511436；2.广州医科大学公共卫生学院，广东广州 511436

槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾，始载于《日华子本草》，《神农本草经》中将其列为上品，现列在国家卫生部第一批药食同源名单中，有凉血止血，清肝泻火等功效[1]。现代药理研究表明槐米具有保护血管[2-3]，改善糖尿病[4]，抑制人鼻咽癌细胞CNE1 增殖并诱导其凋亡[5]，抑菌抗氧化[6-7]和抑制黑色素生成[8-9]等作用。中国是槐米的原产地，世界上98%的槐米来自中国[10]。槐米中富含芦丁和槲皮素等黄酮类成分，其中主要活性成分为芦丁。医药工业中常以槐米为主要原料提取芦丁，销往日本，东南亚和欧美等国家和地区[11-12]。综上，中药槐米及其活性成分芦丁具有较高的药用、食用、保健保养和研究价值。

芦丁为黄酮苷，分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液，酸化后又能游离析出。槐米中提取芦丁常用的方法有回流提取法，碱提取酸沉淀法，超声提取法，水煎煮法[13-16]等，回流提取法和水煎煮法简单方便，成本低，但芦丁的提取率低；超声提取法操作简便，作为辅助方法在中药提取方面有广泛应用[17]。本研究探讨了从槐米中提取芦丁的提取方法，在此基础上考察了碱液的pH值、料液比和静置时间等因素对芦丁提取率的影响，优化了槐米中芦丁的提取工艺，并对自提的芦丁进行了紫外（UV）检识和高效液相色谱（HPLC）检识。旨在为今后深入开发和利用槐米资源提供数据支持。

1 仪器及试剂

1.1 仪器

TLE303E电子天平、FE20实验室PH计[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SYU-7-200T超声波仪、SHZ-D（Ⅲ）循环水多用真空泵、DHG-208B烘箱（郑州生元仪器有限公司）；UV1900紫外分光光度计、LC-20A HPLC高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

1.2 试剂

甲醇（Merck，色谱纯）；冰乙酸（西亚试剂，色谱纯）其他试剂均为分析纯。

芦丁标准品（广州市齐云生物科技有限公司，批号：181027，纯度＞98%）。

槐米（产地：河北；茂名市东亚药业饮片有限公司）由广州医科大学生药学教研室鉴定。用高速多功能粉碎机粉碎，过100目筛，置棕色广口瓶中，于4℃冰箱保存待用。

2 芦丁的提取条件优选

2.1 提取方法对芦丁提取率的影响

平行称取四份槐米粉末各20g于1000mL烧杯中，各加入400mL沸水溶解，边搅拌边小心加入饱和石灰水调节pH至9，分别以超声辅助（70℃，40kHz，200W）提取30min；超声辅助（70℃，40kHz，200W）提取30min，提取2次；电热套加热回流（130℃，微沸）30min，超声辅助（70℃，40kHz，200W）提取30min；电热套加热回流（130℃，微沸）60min四种方法提取芦丁，趁热抽滤，取滤液加浓HCL调节pH至3，静置24h后抽滤，取滤渣，60℃烘干，得芦丁粗提取物。每种方法平行操作3次，计算平均提取率。

表1 提取方法对芦丁提取率的影响（n=3）

结果见表1，单纯超声提取时，提取次数对芦丁的提取率增加并无提高。相同时间内，单纯超声提取或单纯加热回流提取时，超声提取时槐米中芦丁的提取率略高于加热回流提取时的提取率，但两种方式的提取率均不高。在以上提取方式的基础上，与先加热回流30min，再超声辅助提取30min的提取方式相比，后者提取率有较大的提高。综上，在碱提酸沉的基础上，选用先电热套加热回流（130℃，微沸）30min，再超声辅助（70℃，40kHz，200W）提取30min的方法时芦丁的提取率最高。其原理是利用超声波震动所产生的空化效应、机械效应、湍流效应、界面效应和热效应等物理作用，提高中药槐米细胞的通透性，加速槐米细胞壁破裂，使溶剂渗透到槐米的细胞内或使槐米细胞内的化学成分扩散到细胞外[17-18]，从而加速有效成分的溶出。加热回流法和超声辅助提取技术两者相结合，能明显缩短提取时间，有利于槐米中的芦丁快速且高效提出。

2.2 碱液pH值对芦丁提取率的影响

平行称取五份槐米粉末各20g于1000mL烧杯中，各加入400mL沸水溶解，边搅拌边小心加入饱和石灰水分别调节pH至7、8、9、10、11。采用加热回流30min，再超声辅助提取30min的方法提取芦丁，趁热抽滤，取滤液加浓 HCL调节pH至3，静置24h后抽滤，取滤渣，60℃烘干，得芦丁粗提取物。每种条件样品平行3份，计算平均提取率。

图1 pH值对芦丁提取率的影响

图1结果表明，同样条件下，控制碱液pH在7或11附近，芦丁的提取率很低；弱碱状态下，芦丁提取率随着控制碱液pH升高而大幅提高；至pH为8时，芦丁的提取率达到最高，随后缓慢下降。弱碱条件下槐米溶液中的果胶、黏液质等水溶性成分易生成钙盐沉淀，适当浓度的碱液对槐米中芦丁有增溶作用。综上，选择控制碱液pH为8有助于提高芦丁的提取率。

2.3 料液比对芦丁提取率的影响

平行称取五份槐米粉末各20g于1000mL烧杯中，分别加入100、200、300、400、500mL不同料液比的沸水溶解，边搅拌边小心加入饱和石灰水调节pH至8。采用加热回流30min，再超声辅助提取30min的方法提取芦丁，趁热抽滤，取滤液加浓 HCL调节pH至3，静置24h后抽滤，取滤渣，60℃烘干，得芦丁粗提取物。每种条件样品平行3份，计算平均提取率。

图2结果表明，芦丁提取率随着料液比的增加而增加，在料液比为1∶20（g/mL）时达到最大提取率，随后缓慢下降。因此，选取20g槐米粉末样品加入400mL沸水进行提取，即料液比为1∶20（g/mL）时为最优条件。

图2 料液比对芦丁提取率的影响

2.4 静置时间对芦丁提取率的影响

平行称取五份槐米粉末各20g于1000mL烧杯中，各加入400mL沸水溶解，边搅拌边小心加入饱和石灰水调节pH至8。采用加热回流30min，再超声辅助提取30min的方法提取芦丁，趁热抽滤，取滤液加浓HCL调节pH至3，分别静置3、6、12、18、24h后抽滤，取滤渣，60℃烘干，得芦丁粗提取物。每种条件样品平行3份，计算平均提取率。

图3 静置时间对芦丁提取率的影响

图3结果表明，碱提酸沉后抽滤得到的芦丁粗提取物，在静置3～6h内提取率缓慢增加，随着静置时间的增长，芦丁提取产率不断提高，到24h，即静置过夜时，达到最高。中药槐米经碱提酸沉后，需要经一定的时间，让芦丁充分沉淀析出。

3 芦丁的检识

3.1 芦丁的紫外（UV）检识

取芦丁对照品甲醇溶液和自提芦丁甲醇溶液，用紫外分光光度计在200～600nm的波长范围内进行扫描，结果如图4。两者紫外吸收光谱特征一致，均在峰带Ⅰ（300～400nm）和峰带Ⅱ（220～280nm）范围内有特征吸收，这是因为黄酮类化合物存在桂皮酰基及苯甲酰基组成的共轭体系，其甲醇溶液在峰带Ⅰ和峰带Ⅱ范围存在特征吸收。因此，从中药槐米中提取的为芦丁粗提物。

图4 芦丁对照品和自提芦丁的紫外吸收光谱叠加图

3.2 芦丁的HPLC检识

色谱条件：色谱柱为GL Sciences，InertSustain C18（250×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇：水（含0.1%醋酸）=60∶40；流速：1mL/min；柱温：室温；进样量：20μL；检测波长：254nm；分析时间：8min。

取空白甲醇溶液、芦丁对照品溶液和自提芦丁样品溶液在上述色谱条件下进样，记录色谱图。结果见图5，芦丁对照品溶液和自提芦丁样品溶液在同一保留时间出峰，且空白甲醇溶液无干扰，该方法专属性好，自提芦丁较纯。

图5 空白甲醇、芦丁对照品、自提芦丁样品的HPLC分离色谱图

4 讨论

本研究利用芦丁易溶于碱液，在酸液中又会沉淀析出的特性，用碱提酸沉法对槐米中的芦丁进行提取。实验得出：先电热套加热回流（130℃，微沸）30min，再超声辅助（70℃，40kHz，200W）提取30min为最优提取方法。在此基础上，碱液溶解时pH值为8，料液比为1∶20（g/mL），经酸沉淀后静置时间为24h，为最优提取工艺。并用UV法和HPLC法对自提的芦丁进行了检识，结果表明自提的芦丁较纯。加热回流法和超声辅助提取技术相结合，能有效缩短中药槐米中芦丁的提取时间，增加提取率。综上，优化提取工艺后槐米中芦丁的提取率有明显提高，该工艺操作简便，仪器简单，绿色环保，为进一步合理开发利用中药槐米资源和工业化大生产提供数据支持。