MTHFR C677T基因多态性与老年心力衰竭患者心室重构的相关性

王欣丽，陈 亮，姜紫凡，张树风

（1.潍坊医学院临床医学院，山东潍坊261041；2.潍坊中西医结合医院保健中心，山东潍坊261041；3.潍坊市人民医院保健科，山东潍坊261041）

MTHFR C677T基因多态性与老年心力衰竭患者心室重构的相关性

王欣丽1，陈 亮2，姜紫凡1，张树风3

（1.潍坊医学院临床医学院，山东潍坊261041；2.潍坊中西医结合医院保健中心，山东潍坊261041；3.潍坊市人民医院保健科，山东潍坊261041）

目的探讨MTHFR C677T基因的多态性分布，并分析与老年心力衰竭（HF）患者心室重构的相关性。方法入选诊断为老年HF患者98例（HF组），同期查体健康者40例为对照组。所有入选对象利用直接基因测序方法检测MTHFR C677T基因多态性，同时检测血浆同型半胱氨酸（Hcy）、脑钠肽（NT-pro BNP）水平。测量左心室舒张末内径（LVDd）、左心室后壁厚度（LVPWT）、室间隔厚度（IVST）及测算左心室射血分数（LVEF），计算左心室质量指数（LVMI）。结果HF组TT基因型频率和T等位基因频率明显高于对照组（P＜0.05）；HF组Hcy、LVMI、NT-pro BNP均高于对照组，LVEF低于对照组（P＜0.05）；不同MTHFR C677T基因型者其血浆Hcy水平差异有统计学意义（P＜0.05）。HF组伴左心室肥厚组，TT基因型频率及T等位基因频率高于HF组不伴左心室肥厚组。HF组TT基因型患者LVMI高于CT及CC基因型患者，而LVEF则低于CT及CC基因型患者。结论MTHFR C677T基因型与老年HF患者心室重构相关，TT基因型及T等位基因的老年HF患者发生心室重构的可能性大。

心力衰竭；心室重构；多态性，单核苷酸；半胱氨酸；老年人

心力衰竭（heart failure，HF）是各种心脏疾病的终末阶段，从病理生理看主要为早期代偿性心肌肥厚到失代偿性HF的过程，心室重构（ventricular remodeling，VR）是HF发生的根本。当前评估左心室心肌肥厚的重要指标是左心室质量指数［1］（left ventricular mass index，LVMI）。随着老龄化社会程度的加重，我国HF的发病率和患病率逐年上升，医疗支出比重大。2015年的一项流行病学调查显示，中国HF患者高达400万，成年人HF的患病率为0.9%［2］，随着年龄增长患病率升高。目前认为MTHFR C677T C→T突变后，造成高同型半胱氨酸血症（hyper homocysteine，HHcy）［3］，是心血管疾病的独立危险因素。而关于MTHFR C677T基因多态性与HF及心室重构的研究尚少。本研究探讨老年HF患者MTHFR C677T基因多态性分布及与心室重构的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2014年9月至2015年9月潍坊市人民医院保健科、心内科确诊为老年HF的患者98例（HF组），男52例，女46例，所有入选者年龄均≥65岁，平均年龄（77.2±10.2）岁，其中冠心病34例，冠心病伴高血压心脏病17例，冠心病合并糖尿病20例，冠心病合并肺心病22例，心脏瓣膜病5例。选择同期40例体检健康的老年人作为对照组，男19例，女21例，平均年龄（69.5±4.4）岁。两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。HF诊断按照Framingham标准［4］。根据患者病史、症状、体征、心电图、胸部X线及超声心动图等综合诊断。排除标准：除外严重肝、肾功能不全，血液免疫系统疾病、严重感染、肿瘤和恶性心律失常等。

1.2 数据收集及标本准备 研究对象一般临床资料包括：性别、年龄、身高、体质量、吸烟史、糖尿病史及高血压病史。所有观察对象于次日清晨空腹（禁饮食12小时）抽取外周静脉血，测定总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）、同型半胱氨酸（HCY）、脑钠肽（NT-pro BNP）等，另取5 ml静脉血置于内含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tertra acete，EDTA）抗凝剂的试管中，于－70℃冰箱保存，用于提取DNA，待测MTHFR基因多态性。

1.3 MTHFR C677T基因多态性测定 ①DNA提取：取所有观察者的冷冻乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝外周血，于37℃水浴迅速融化，采用全血基因组DNA快速提取试剂盒（天根生物）提取基因组DNA（提取方法按照厂家说明书步骤操作）。②PCR基因扩增：根据MTHFR基因序列，设计扩增引物为上游引物F：TGCCCAGTCCCTGTGGTCTCT下游引物R：GCCTTCACAAAGCGGAAGAAT由北京尤比爱生工合成。热启动DNA聚合酶购自大连宝生物公司。扩增条件：94℃解链5 min×1个循环；94℃变性30秒；60℃退火30秒；72℃延伸30秒35个循环；72℃延伸5分钟1个循环。③基因测序：将PCR产物各取30μl送尤比爱生物工程（北京）股份有限公司基因测序。

1.4 左心室各指标测定 所有观察对象均于潍坊市人民医院超声科行心脏彩色超声检查，应用GE vivid E9彩色多普勒超声，分别测量左心室舒张末期内径（LVDd）、室间隔厚度（IVST）、后壁厚度（LVPWT），左心室射血分数（LVEF），所有指标均测量3个心动周期后取平均值。根据Deiereux公式计算左心室质量（LVM），LVM（g）＝1.04×［（IVST＋PWT＋LVDd）3-LVDd3］－13.6，进而计算LVMI，LVMI（g／m2）＝LVM／BSA（体表面积），BSA（体表面积）（m2）＝0.0061×身高（cm）＋0.0128×体质量（kg）－0.1529。左心室肥厚（LVH）诊断标准，根据推荐标准：男＞125 g／m2女＞110 g／m2。

1.5 统计学方法 应用SPSS 17.0软件包进行统计处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，分类资料采用百分比表示，组间频率比较用χ2检验，组间连续变量采用单因素方差分析或独立样本t检验，Hardy-Weinberg平衡检验基因分布，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料比较 HF组在吸烟史、高血压病、FBG、TG、LDL-C和Hcy均高于健康组，HDL-C低于对照组（P＜0.05）；两组性别、年龄、身高、体质量和TC差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 MTHFR基因C677T测序结果 HF组和对照组所研究人群经χ2拟合优度检验均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（χ2＝1.080，P＞0.05），说明研究样本具有群体代表性。HF组T等位基因的频率与TT基因型频率分别为57.0%，35.7%，明显高于对照组（P＜0.01）。两组T等位基因频率分布差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。各基因型测序结果见图1～3。

表2 两组基因型及其等位基因分布比较

图1 CC基因型图谱 灰色标注处提示样本为野生型CC基因型

图2 CT基因型图谱 灰色标注处提示为C、T双峰重叠，样本实为C、T突变杂合子

图3 TT基因型图谱 灰色标注处提示所指C→T突变纯合子

2.3 不同基因型间各指标比较 HF组TT基因型的Hcy、LVMI、Lg（NT-pro BNP）明显高于CT、CC基因型，而LVEF明显低于CT、CC基因型（P＜ 0.05）。对照组中Hcy、Hcy、LVMI、Lg（NT-pro BNP）差异无统计学意义（P＞0.05），由于NT-pro BNP不服从正态分布，采用非参数检验，HF组与对照组各指标比较，两组Hcy、Lg（NT-pro BNP）、LVEF（%）、LVMI差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 不同基因型间各指标比较（±s）

注：与TT基因比较，*P＜0.05

组别基因型例数Hcy（μmol／L）Lg（NT-pro BNP）LVEF（%）LVMI（g／m2）对照组CC 21 10.26±2.25 2.01±0.36 68.2±10.2 91.11±18.63 CT 13 11.45±2.63 2.24±0.47 68.1±10.3 90.21±19.68 TT 6 11.41±2.95 2.21±0.52 67.8±28.2 91.68±19.53 F值0.302 0.494 1.677 0.241 P值＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05组别基因型例数Hcy（μmol／L）Lg（NT-pro BNP）LVEF（%）LVMI（g／m2）HF组CC 20 11.26±2.43*3.83±0.42*42.23±7.43*133.34±28.17*CT 43 15.51±2.57*3.82±0.41*37.24±6.30*159.46±23.69*TT 35 21.34±2.72 3.89±0.44 31.10±8.34 163.45±23.34 F值39.012 23.345 3.498 408.229 P值＜0.01＜0.01＜0.05＜0.01

2.4 MTHFR基因C677T基因多态性 HF组中伴左心室肥厚组与不伴左心室肥厚组基因型分布、等位基因分布差异有统计学意义（P＜0.01）。HF伴左心室肥厚组Hcy水平高于不伴左心室肥厚组。见表4。

3 讨 论

冠心病和高血压病是目前我国HF的主要病因。HF时心脏收缩舒张功能紊乱，泵血功能减弱，心室内血液滞留严重，室壁张力增加，从而发生心室重构。彩色超声检查可见各室腔内径变大，心脏LVEF下降。MTHFR基因通过改变Hcy水平影响心血管系统，未来可能成为筛选心血管疾病的候选基因。人类MTHFR基因位于染色体第1号染色体，有11个外显子和10个内含子组成，有20多种突变位点，其中以C677T和A1298C位点最为常见［5］。MTHFR基因突变位点于1995年首次被发现，该位点突变是心血管疾病的一个重要危险因素［6］。MTHFR C677T突变后导致其编码蛋白质的氨基酸结构发生变化，第677位点缬氨酸被丙氨酸取代，改变了MTHFR酶的活性，造成HHcy。

表4 HF两型组MTHFR C677T多态性分布

随着年龄增加，老年人心血管弹性减低，患病风险升高，体内代谢异常，易导致MTHFR基因多态性发生，引起MTHFR酶活性下降，导致Hcy水平升高。近年来有关Hcy与HF研究颇多，2011年Veeranna等［7］在研究Hcy与冠心病关系时发现，HHcy可导致冠心病患者发生HF的概率倍增。Herrmann［8］研究显示HHcy不仅与HF的发生有关，而且还与其严重程度有关。一项对Framingham心脏研究中心的2 000多例研究对象调查后发现，在女性观察者中血浆Hcy水平与左心室质量及厚度呈正相关，在男性观察者中未发现有相关性［9］。Blacher等［10］一项对在慢性肾脏病终末期患者的研究中发现，血浆Hcy与LVMI具有相关性，HHcy可以增加终末期肾脏病患者左心室肥大风险性。马素霞等［11］对131例高血压病患者，根据Hcy水平分为H高血压组和非H高血压组，发现Hcy可加重老年高血压病患者的左心室肥厚。Fu等［12］研究表明H Hcy是冠心病的独立危险因素，是心血管事件的独立预测因子。上述研究证实Hcy水平与慢性HF有关，也与病情的严重程度有关。本研究结果示HF组Hcy明显高于对照组，高Hcy可能是HF发病的危险因素。对各组不同基因型进行了Hcy比较，发现HF组TT基因型组的Hcy最高，CT组次之，CC组最低，说明Hcy的升高与纯和TT突变有关。HF伴左心室肥厚组Hcy水平高于不伴左心室肥厚组，说明Hcy与心室重构有一定关系。

近年来对MTHFR基因的研究成为焦点，发现其与多种疾病有关，研究最多的为心脑血管疾病［13］。有关研究发现MTHFR TT基因型能增加高血压患者冠心病的风险［14］。王晟等［15］发现Mir-499b通过增强MTHFR的表达降低血清Hcy的表达量减少老年慢性HF的发病率。当MTHFR基因发生突变时，MTHFR酶活性改变，使Hcy水平升高，Hcy与老年HF关系密切，推测MTHFR基因与老年HF有关。本研究可见HF组中TT基因型频率明显高于对照组，T等位基因频率分布高于对照组，提示MTHFR基因C677T位点TT基因型及T等位基因频率与HF的发病有关。TT基因型频率或T等位基因频率可能是老年HF发病的危险因素。对HF组基因型分组研究后发现，TT基因型组LVMI和Lg（NT-pro BNP）显高于CT、CC组，LVEF低于CT、CC组，提示TT基因型可能与心室重构及心功能严重程度有关。随着心功能分级增加，LVEF下降，基因型不同LVEF也不同，LVEF可能与T等位基因频率有关；LVMI在TT基因型组中最高，CT基因型组中次之，可见不同基因型中心肌肥厚程度不同，即心室重构水平不同，病情严重程度不同。LVMI是目前反映心室重构最佳指标，能排除身高、体质量及个体大小等影响因素。老年HF组伴LVH者T等位基因频率及TT基因型频率明显高于无LVH的HF患者，提示携带TT基因型的HF患者更易发生心室重构。推测TT基因型者血浆Hcy水平高，其对心血管的影响加快了心室重构的进程。研究发现［16-18］Hcy通过氧化应激反应，导致一氧化氮（NO）功能失活，损伤内皮依懒的血管舒张功能，致细胞间的支架结构严重受损致，从而对心肌及心肌细胞产生的损害，发生心肌重塑。也可以通过增加其金属蛋白酶活性，导致心肌肥大和心肌组织损伤，加剧心肌纤维化，引起心肌重构。Hcy也可导致血管壁重构。国内外有关MTHFR基因C677T与心室重构机制的研究甚少，推测基因可能是通过改变Hcy水平，进而对心室重构产生影响。

总之，本研究发现MTHFR C677T基因多态性和老年HF患者心室重构有一定相关性，研究以LVMI作为心室重构的量化指标，更接近真实情况。然而HF的病理生理过程非常复杂，尽管有研究显示心室重构、基因多态性可能是其发生发展的关键因素，但其发病机制还未明确。本研究入选的样本量有限，研究过程中没有考虑到饮食、环境等因素的影响，所得的结论仍需要更多的大样本临床研究进行验证。

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MTHFR C677T gene poIymorphism and ventricuIar remodeIing in eIderIy patients with heart faiIure

Wang Xinli1，Chen Liang2，Jiang Zifan1，Zhang Shufeng3
1.The Clinical Medical College，Weifan g Medical University，Weifan g 261041，China；2.Health Care Center，Weifang Integrated Traditional Chinese an d Western Medicine Hospital，Weifang 261041，China；3.Department of Health Care，Weifang People＇s Hespital，Weifang 261041，China Corresponding author：Chen Liang，Email：wfbjliang＠163.com

ObjectiveTo investigate the distribution of MTHFR C677T genotypes on the subjects，and analyze its relationship to the ventricular remodeling in elderly patients with heart failure（HF）.MethodsThe study involved 98 patients with HF as HF group，40 health people from body check as normal control group.MTHFR C677T gene polymorphism was detected by PCR-direct sequencing method.Meanwhile，plasma total homocysteine（Hcy）and brain natriuretic peptide（BNP）were measured.Left ventricular remodeling was evaluated by calculating the left ventricular end-diastolic diameter（LVDd），left ventricular posterior wall thickness（LVPWT），interventricular septal thickness（IVST）and left ventricular ejection fraction（LVEF），left ventricular mass index（LVMI）of the subjects in two groups.ResuItsCompared with those of control group，the genotype TT and allele T frequencies of C677T in MTHFR gene in HF group were significantly higher（P＜0.05）.Hcy，LVMI and NT-pro BNP in HF group were higher than those in control group（P＜0.05）.In HF group，LVMI was the highest，while LVEF was the lowest in TT genotype among three genotypes（P＜0.05）.The frequencies of genotype TT and allele T in HF group with left ventricular hypertrophy（LVH）group were higher than those in HF without LVH group（P＜0.05）.ConcIusionThe MTHFR genotypes have correlation with the ventricular remodeling in elderly HF patients，and the patients with TT genotype or T allele are easier to develop into LVH.

heart failure；ventricular remodeling；polymorphism，single nucleotide；cysteine；aged

R541.6

：A

：1004-583X（2017）03-0212-05

10.3969／j.issn.1004-583X.2017.03.008

2016-10-17 编辑：武峪峰

山东省医药卫生科技发展计划项目（2013WS0047）

陈亮，Email：wfbjchliang＠163.com