人肺癌细胞特异性结合肽的筛选与验证

樊敏杰，金 瑾，韩化敏

(拜西欧斯(北京)生物技术有限公司，北京 100070)

肺癌发生于支气管黏膜上皮，发病率和死亡率增长最快，近50 a来肺癌的发病率显著增高，在欧美工业发达国家和我国的一些工业大城市中，肺癌发病率在男性恶性肿瘤中已居首位，在女性中发病率也迅速增高，是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1-2]。由于发病隐匿，早期多无症状，几乎2/3的肺癌患者在就诊时已是晚期(Ⅲ～Ⅳ期)，我国肺癌早期诊断率较低，患者5 a生存率仅有10%，国外发达国家是15%～20%[3-4]，这个差距就是早期诊断问题。临床上传统的诊断方法如胸片、支气管镜、痰细胞学检查等方法，缺乏足够的特异性和敏感性，因此市场上急需开发出一种用于临床诊断方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料 随机十二肽噬菌体展示试剂盒购自美国New England Biolabs公司，包括随机十二肽噬菌体展示文库(1.5×1013pfu·mL-1)、E.coli ER2738 宿主菌、-96 gⅢ测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’；人支气管上皮细胞16HBE购自广州吉妮欧生物技术有限公司；人肺癌细胞A549由中国科学院生物物理研究所赠送；M13单克隆抗体购自北京义翘神州科技有限公司。

LB培养基：每L含：10 g细菌用胰蛋白胨(英国Oxoid公司，批号LP0042)，5 g酵母提取物(英国Oxoid公司，批号LP0021)，5 g NaCl(上海索莱宝生物科技有限公司，批号S8211)。高压灭菌，室温贮存。

LB/IPTG/Xgal平板：将0.25 g异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG，上海索莱宝生物科技有限公司，批号I8070)溶于5 mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)溶液中。溶液于-20 ℃避光贮存。向LB培养基中加入琼脂粉(15 g·L-1)，高压灭菌，冷却至低于70 ℃时，加入1 mL IPTG/Xgal，混匀后平铺在无菌的细菌用培养平板中。琼脂凝固后将平板于4 ℃避光贮存。

顶层琼脂：每L含：10 g细菌用胰蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g NaCl，1 g MgCl2·6H2O，7 g琼脂粉。高压灭菌，分成50 mL等份。将凝固后的固体培养基贮存于室温，用时微波炉融化。

四环素(Tet)(上海索莱宝生物科技有限公司，批号T8180)贮液：以20 mg·mL-1的浓度溶于乙醇中。-20 ℃避光贮存。用前摇匀。

LB-Tet培养基：1 L LB培养基加入1 mL Tet贮液。

LB-Tet平板：向LB培养基中加入琼脂粉(15 g·L-1)，高压灭菌，冷却至低于60 ℃时，加入1 mL Tet贮液，混匀后平铺在无菌的细菌用培养平板中。凝固后将平板于4 ℃避光贮存。如果平板显棕色或黑色则不宜使用。

封闭缓冲液：以质量分数3%将脱脂奶粉(美国BD公司，批号232100)溶于磷酸盐缓冲液中。过滤除菌，4 ℃贮存。

PEG/NaCl：含2.5 mol·L-1NaCl的质量分数20%聚乙二醇(PEG)-8000(上海索莱宝生物科技有限公司，批号p8260)。高压灭菌，室温贮存。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞准备 购买复苏细胞接收到货后，更换新的含质量分数10%高糖DMEN培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2孵箱内培养。细胞融合达80%以上质量分数0.25%胰酶进行传代，培养3代后取对数生长期细胞进行实验。A549细胞同16HBE培养方式一致，培养3代以上可使用。

1.2.2 随机十二肽噬菌体筛选 取一个培养于T175瓶生长达90%饱和的16HBE细胞，用质量分数 0.25% 的EDTA消化，计数取1×107个300 g离心5 min，弃上清，用含质量分数3%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液重悬封闭细胞，4 ℃ 2 h。取10 μL原始噬菌体肽库即1.5×1012的噬菌体稀释到1.5 mL封闭液内，37 ℃ 2 h。封闭过的噬菌体与16HBE细胞混合，孵育吸附2小时。孵育期间取1个培养于T175瓶生长达90%饱和的A549细胞，用质量分数0.25%的EDTA消化，计数取1×107个细胞300 g离心5 min，1.5 mL封闭液重悬，封闭2 h。将孵育完毕的16HBE细胞，400 g离心5 min，小心吸出上清加入封闭过的A549细胞，孵育2 h。将A549细胞300 g离心5 min，弃掉上清，加入1.5 mL磷酸盐缓冲液洗涤细胞，重复洗涤10次，将细胞重悬于1 mL磷酸盐缓冲液中。取10 μL测定滴度，剩余噬菌体感染E.coli ER2738宿主菌进行扩增，用于下一轮筛选。重复以上操作进行第2、3、4轮筛选。除第1轮投放噬菌体原始文库，第2、3、4轮分别采用上一轮洗脱液扩增噬菌体，其余条件均与第1轮一致。每轮筛选前后均使用LB/IPTG/Xgal琼脂平板测定噬菌体滴度。并计算回收率。经4轮淘筛过后，将获得的特异性噬菌体肽库，培养于LB/IPTG/Xgal琼脂平板上，挑分离良好的蓝色噬菌斑进行扩增。短期4 ℃保存备用。

1.2.3 阳性克隆ELISA初步鉴定 将A549细胞以5×104/孔的密度，接种于96孔板，置CO2培养箱培养24 h后，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，加质量分数4%多聚甲醛37 ℃固定30 min；加200 μL/孔封闭液37 ℃ 1 h；磷酸盐洗涤3遍，加噬菌体样品孵育2 h；磷酸盐洗涤3遍，加50 μL/孔2 000倍稀释的M13抗体，37 ℃孵育1 h；洗涤4遍后加100 μL TMB显色；加50 μL孔2 mol·L-1H2SO4终止，酶标仪450 nm读数。以M13K07作为阴性对照，P/N>3为阳性。共筛选394个克隆，初步挑选读数较高的10个克隆进行下一步验证，分别为140、141、179、193、217、278、290、295、362、385。

1.2.4 细胞ELISA检测阳性克隆靶向性 细胞培养数量满足时，分别将16HBE细胞、A549细胞用质量分数0.25%的EDTA消化，计数取每份5×106个于2 mL离心管内，各取9份，300 g离心5 min，1 mL封闭缓冲液重悬于2 mL离心管内，4 ℃摇动封闭1 h。同时，将以上得到的每个噬菌体克隆取0.5 mL于2 mL离心管，再分别加入0.5 mL封闭缓冲液，孵育1 h。另取M13K07辅助对照噬菌体同样方法做封闭处理。将封闭结束的细胞与封闭结束后的噬菌体混合到15 mL离心管内，4 ℃摇动孵育2 h。将细胞300 g离心5 min，小心吸除上清液，加入1 mL 磷酸盐缓冲液吹洗均匀，再300 g离心5 min。如此反复洗涤细胞5次。将经封闭缓冲液2 500倍稀释的M13抗体分别取0.5 mL加到各份细胞内重悬，4 ℃摇动孵育1 h。再洗涤5遍。用100 μL TMB显色，加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4终止反应，酶标仪450 nm处读数。重复3次实验，显示278号克隆均呈现高亲和力。

1.2.5 噬箘体克隆测序分析 将噬箘体扩增上清液，用-96 gⅢ测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’送北京金唯智生物科技有限公司全自动测序并分析。

2 结果

2.1 随机十二肽噬菌体筛选与分析结果 以16HBE细胞为非特异性吸附，A549细胞为靶细胞，完成4轮的淘筛，通过滴度测定对每轮的投入量与回收量进行分析，呈现逐渐递增的富集效果。见表1。

表1 差减吸附筛选噬箘体富集效应

2.2 阳性克隆ELISA初步鉴定 通过ELISA对第4轮淘筛后394个噬箘体克隆进行初步鉴定，并分析其与肺癌细胞结合情况，以M13K07噬箘体为阴性对照排除非特异性结合。以实验组与对照组OD450 nm比值≥3为标准，优选出最高的10组克隆，分别为140、141、179、193、217、278、290、295、362、385。见图1。

图1 与A549细胞高亲和力噬箘体克隆

2.3 细胞ELISA检测阳性克隆靶向性 选以上10个阳性克隆，分别与16HBE细胞、A549细胞进行细胞水平ELISA，鉴定其靶向性，结果显示，278号淘筛噬箘体克隆显示出与A549细胞高的靶向性。此克隆与A549高亲和力，而与16HBE几乎没有结合。见图2。

图2 噬箘体克隆靶向性结合情况

2.4 DNA测序及同源性分析结果 将278号克隆(同时将179、193、290、295测序，分析同源性需要)送至北京金唯智生物科技有限公司用试剂盒自带96 gⅢ测序引物测序，推导出278号噬菌体克隆DNA序列为AGTGATTGGAAGCTTTATACGCAGCCTATTACTCTG，其所编码的12个氨基酸的多肽的氨基酸序为SDWKLYTQPITL，同时另外4个克隆除295外，均为SDWKLYTQPITL。说明此序列存在高重复率。经BLAST数据库比对，未发现肺癌相关已知序列，很可能为新发现靶点序列。

3 讨论

噬菌体展示技术建立于1985年,该技术通过基因工程改造，将外源基因与丝状噬箘体融合，获得的重组噬菌体能被特定抗体所识别。而后在多领域得到了发展:新型疫苗研制方面的应用、酶抑制剂筛选中的应用、医学诊断和治疗方面的应用。近年来主逐渐成为肿瘤靶向治疗的研究方向之一[5-7]，在体外已成功淘筛到针对神经胶质瘤细胞、鼻咽癌细胞等特异性结合肽，可能在肿瘤的诊断、靶向治疗等方面具有潜在的临床应用价值[8-9]。肿瘤标志物是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、细胞、体液中，反映肿瘤存在和生长的一类物质。其具有高效、高灵敏、方便、标本易获取及创伤轻等优点，因此检测、筛选及鉴定肿瘤标志物一直是肺癌早期诊断研究的重点。

本研究利用A549细胞为靶细胞，16HBE细胞为吸附细胞，经过4轮淘筛，共挑选了394个克隆初步进行非特异性排除，优选了10个高亲和力克隆进行后续的靶向性鉴定，结果得到1个克隆与A549细胞高亲和力，而与正常16HBE细胞不结合。测序后得到其序列，数据库BLAST未有肺癌已知相关序列，但与芽孢杆菌属硫酸酯酶存在同源性，查阅文献又发现Proteobacteria门细菌与人高度同源[10]， 其配体硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，在肿瘤生物学作用的酶是C6-内脱磺基酶(endo-6-O-sulfotase,Sulf),其功能是选择性去除葡萄糖酰胺六号碳上的磺基。Sulf在哺乳细胞内有2个异构体,即Sulf1和Sulf2。与肝素酶类似,修饰酶在多数肿瘤组织中表达增高,可能通过调节某些生长因子的活性，从而促进肿瘤的进一步恶化[11]。但肺癌细胞并未见相关研究报道，结合机制需要做近一步研究。但已说明噬箘体展示技术在寻找肿瘤特异性识别多肽的领域具有重要价值，为临床诊治提供了新的实验依据。

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