北京鸭BNIP3L基因CDS区克隆及序列分析

（四川省达州市农业科学研究院，四川达州635000）

北京鸭BNIP3L基因CDS区克隆及序列分析

甘伟，任小春，任小松

（四川省达州市农业科学研究院，四川达州635000）

BNIP3L定位于线粒体，广泛分布于各个组织中，具有促凋亡的作用。根据NCBI上鸭BNIP3L基因预测序列设计引物，利用PCR技术，对鸭BNIP3L基因CDS区序列进行克隆。结果表明：扩增出BNIP3L基因的CDS区序列全长为543bp，编码180个氨基酸，相对分子质量为19.52 ku，理论等电点为6.334。另外，该氨基酸序列存在典型的3个低密度区域和1个跨膜结构域。经比对分析发现鸭的BNIP3L基因具有特有的保守序列，而且与鸟类的BNIP3L基因具有较高的相似性，并对其氨基酸序列和蛋白质结构进行了分析，整个多肽链中疏水性氨基酸为151个，亲水性氨基酸为29个，因此整个多肽链应为疏水性。其蛋白质二级结构由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成，分别占22.78%、7.22%、17.78%和52.22%。以上数据表明北京鸭BNIP3L基因CDS区序列与安氏蜂鸟、朱鹮、鸡具有较高的一致性，且在物种进化过程中较为保守。

北京鸭；BNIP3L；基因克隆；序列分析

BNIP3L最早是从人胎肝cDNA文库中克隆得到的，由6个外显子和5个内含子组成，mRAN全长1 337 bp，属Bcl-2家族中的BH3-only亚家族，是BNIP3的同族体，定位于线粒体且在人体各组织中均有表达［1］。近年来，BNIP3L基因在癌细胞中的研究已引起广泛关注。在前列腺癌组织研究中发现，BNIP3L主要分布于胞浆中，其较正常的前列腺组织表达增加，进一步对BNIP3L表达与前列腺癌患者的临床因素进行相关性分析发现BNIP3L的表达与患者总生存率的降低显著相关。即BNIP3L可通过调节前列腺癌细胞的生物学行为，从而参与前列腺癌的发生与发展。同时，BNIP3L定位于8p21肺癌高频杂合性丢失区，能与Bcl-2、EBI9K等抗凋亡蛋白相互作用，促进细胞凋亡［2］。

鉴于BNIP3L基因在细胞发育过程中具有重要调控作用，通过从分子角度分析其结构和功能，进而为遗传育种在分子水平上进一步发展奠定基础。该研究采用RTPCR技术扩增出北京鸭BNIP3L基因CDS区序列，利用现代生物信息学技术进行序列分析，探讨其与其他物种之间的亲缘关系，以期为全面揭示北京鸭BNIP3L基因的蛋白表达和功能研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 扩增引物

目前，NCBI上绿头鸭的BNIP3L基因CDS区序列（登录号：XM_005024485），用Primer Premier5.0软件设计PCR引物，引物由北京华大生物技术公司合成。

1.2 总RNA提取及反转录

取北京鸭（四川农业大学水禽育种场提供）腿肌肌肉组织样，置于液氮中冷冻并进行研磨。取100mg研磨好样品用Trizol法提取鸭腿肌的总RNA。采用Prime Scrip RT reagent Kit的mRNA反转录试剂盒，将提取的总RNA反转录成单链cDNA，-20℃保存。

1.3 目的片段PCR扩增

以北京鸭cDNA为模板进行扩增，PCR反应总体积为50 μl，其中cDNA为5 μl，上下游引物个2 μl，PCR Master mix 25 μl，ddH2O 16 μl，扩增条件为95℃预变性5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃延伸2 min，34个循环，72℃10 min。待反应结束，使用电泳仪进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度一般为1.5%。Gel Extraction Kit胶回收试剂盒（Omega，USA）回收目的片段，将纯化后的PCR产物同pMDl9-T（TaKaRa，Japan）载体连接并转化到DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆菌接种并进行摇床培养，菌液PCR鉴定后挑选阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序。

1.4 序列分析

DNAman序列分析软件将DNA序列翻译成蛋白质序列，并对翻译的序列进行分析；多序列比对采用Clustal W（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）软件。信号肽查找用Sigal P 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP-3.0/）程序分析。蛋白功能预测应用软件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）完成。在线软件（http：// prosite.expasy.org/）预测氨基酸结构域。采用MEGA4.0软件构建系统发育分子系统NJ树，遗传距离选择Kimura2-parameter模型，构建NJ树采用重复抽样分析1 000次检验分子系统树各分支的置信度。应用ProtScale程序（http：//expasy.org/cgibin/protscale.pl）进行蛋白质的疏水性分析。

2 结果与分析

2.1 鸭BNIP3L基因克隆

根据GenBank上发表的鸭BNIP3L基因的CDS区预测序列设计引物，以北京鸭的腿肌cDAN为模板进行扩增，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳电压为180V，电泳10 min，最终得到产物清晰且特异性较好的目的条带，长度与推算结果相符。

2.2 鸭BNIP3L基因两种剪切体测序结果及氨基酸序列预测

ORF Finder在线软件分析，最长开放阅读框均为543bp，编码180个氨基酸，含有起始密码子和终止密码子在内的完整开放阅读框（ORF），氨基酸序列不存在信号肽序列，说明BnIP3编码的蛋白为非分泌蛋白，相对分子质量为19.52 ku，推测的蛋白等电点为6.334。该氨基酸序列存在典型的3个低复杂度区域和1个跨膜结构域。

2.3 鸭BNIP3L基因编码区核苷酸和氨基酸序列同源性分析

运用DNAMAN软件将鸭BNIP3L基因核苷酸和氨基酸序列分别与安氏蜂鸟、朱鹮、斑胸草雀、鸡、绵羊、牛、猪、人、家鼠、鲨鱼等物种进行同源性分析，结果表明北京鸭BNIP3L的核苷酸序列与各物种的同源性分别为95.76%、95.76%、62.08%、79.17%、60.91%、67.73%、68.79%、68.79%、67.12%、61.45%，氨基酸的同源性分别为98.33%、98.33%、65.41%、82.33%、67.12%、73.52%、73.85%、74.43%、73.39%、60.85%。

2.4 鸭BNIP3L基因的分子进化分析

利用MEG5.1软件，将该试验所得到的鸭BNIP3氨基酸序列与安氏蜂鸟、朱鹮、牛、猪、人、鲨鱼等物种进行多重序列比对并进行系统进化树的构建。BNIP3L进化树分化为鸟类、哺乳类和鱼类三支，其中鸭与鸟类亲缘关系较近，处于进化树同一分支上，而与鱼类的亲缘关系最远。

2.5 鸭BNIP3L基因蛋白二级结构预测

蛋白质的二级结构主要包括无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链。用ProtScale程序对BNIP3L编码的多肽链进行亲水性分析。正值越大表示该区域越疏水，负值越大表示该区域越亲水。位于158位的组氨酸（His）值最高，为2.3，疏水性最强；分别位于10和11位的天冬酰胺（Asn）和甘氨酸（Gly）值最低，为-2.556，亲水性最强。整个多肽链中亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，预示着该蛋白可能是亲水性的。

3 讨论

随着分子生物学、分子遗传学以及转基因动物技术的发展，育种研究已不再局限于通过表型差异进行优良性状的选择，分子标记技术开始大量的运用于现今的育种中。细胞的凋亡过程是一个多调控因子共同参与的过程，BNIP3L可与其他调节因子相互作用，共同参与调控细胞的凋亡。研究已表明，作为凋亡家族成员之一，BNIP3L在缺氧诱导细胞凋亡过程中起重要调控作用，其即可通过激活Caspase信号通路，也可通过与BAX、BAK、Bcl-2、E1B19K、Bcl-XL等抗凋亡蛋白相互作用，增加线粒体膜通透性，进而促进细胞凋亡［3］。检测4种肺癌细胞株中BNIP3L的mRNA表达，发现其表达水平与HBE4-E6/E7细胞相比无明显差异。

BNIP3L编码蛋白含有凋亡效应结构域和跨膜结构域，可与相关凋亡蛋白相互作用，参与细胞凋亡过程。而当前BNIP3L的研究主要集中在人癌细胞上，在禽类上鲜有报道。本研究通过RT-PCR扩增了北京鸭BNIP3L基因的CDS序列，并对其序列进行了序列同源性比较，发现核苷酸序列和氨基酸序列与鸟类的同源性均达到85%以上，而与人、小鼠、哺乳动物及水栖类均达不到60%，说明北京鸭和鸟类BNIP3L基因在功能上可能相似。通过对北京鸭BNIP3L的编码区准确克隆，可为进一步在蛋白水平上分析研究BNIP3L的功能提供理论依据。

［1］Yasuda M，Han JW，Dionne CA，et al.BNIP3a：AHumanHomologofMitochondrialProapoptotic Protein BNIP3［J］.Cancer Res，1999，59（3）：533-537.

［2］孙继丽，贺修胜，余艳辉，等.BNIP3L基因在肺癌组织中的表达及结构分析［J］.基础研究，2004，23（1）：8-14.

［3］Whitaker-MenezesD1，Martinez-OutschoornUE，Flomenberg N，et al.Hyperactivation of oxidative mitochon⁃drial metabolism in epithelial cancer cells in situ Visual⁃izing the therapeutic effects of metformin in tumor tissue［J］.Cell Cycle，2011，10（23）：4047-4064.

S834.+81

：B

：1004-5090（2017）07-0009-02

2017-05-12）