氨基糖苷类药物耳毒性机制研究

何 强，张 颖(综述)，任秀敏(审校)

(河北医科大学第二医院耳鼻咽喉科，河北 石家庄 050000)

·综述·

氨基糖苷类药物耳毒性机制研究

何 强，张 颖(综述)，任秀敏(审校)

(河北医科大学第二医院耳鼻咽喉科，河北 石家庄 050000)

氨基糖苷类；药物毒性；药理作用分子作用机制

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.031

自氨基糖苷类抗生素(aminoglycoside antibiotic,AmAn)广泛应用于临床以来，由AmAn致聋的病例时有发生。AmAn是化学结构中含有氨基糖分子的一类抗生素，较主要的有链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素和新霉素等。AmAn主要作用于革兰阴性菌，抗菌作用原理是阻碍细菌蛋白质的生物合成。这类药物可能会对肾脏、前庭和耳蜗造成不同程度的损伤[1]。近年来，对AmAn的耳蜗毒性机制[2]进行了深入细致的研究，形成了许多种学说，但这些学说并不能完全解释这类药物耳毒性的机制，随着科学技术的进步，从分子水平上对AmAn耳毒性机制的研究进一步深入，取得了一定的突破，并在药物治疗AmAn所致耳蜗毒性和预防耳蜗损伤上有所进展,现综述如下。

1 氧自由基与氨基糖苷类药物耳毒性

1.1耳蜗氧自由基形成 自由基是指带有不成对电子的分子、原子、原子团或离子。氧自由基是生物体内有氧代谢产生的含氧的自由基，包括羟自由基OH、超氧阴离子O2-、烷氧自由基RO及烷过氧自由基等。对氧自由基检测可采用电子顺磁共振法。氧自由基对生物大分子具有很强的损伤作用，可造成细胞的多种功能紊乱，特别是可引发线粒体损伤。氧的利用率高，是氧自由基的一个重要来源。耳蜗线粒体的DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)可编码呼吸链细胞色素b，细胞色素c氧化酶亚单位CoⅠ、CoⅡ、CoⅢ，ATP合成酶6，ATP合成酶8。mtDNA损伤常造成这些酶的活性部分或全部丧失[2]，而这些酶是线粒体呼吸链的重要组分，活性丧失使呼吸链氧化磷酸化功能出现异常，线粒体电子漏增多，从而改变了电子载体的氧化还原电位，O2-和OH自由基明显增多。有研究报道，AmAn在耳蜗毛细胞积累的主要部位是线粒体，可刺激氧自由基产生[3]。推测是AmAn可与铁通过铁-AmAn复合物的形成[4]，诱发谷氨酸兴奋毒性作用[5-6]和细胞内游离Ca2+增多[7]的原因。

1.2耳蜗内的抗氧化系统 在耳蜗的细胞中存在着各种各样的氧自由基清除剂，如维生素C、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)等。耳蜗的抗氧化防御系统主要存在于Corti′s器和血管纹[7]。SOD是一种金属酶，可分为CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 3种。已有研究发现在耳蜗中也有SOD的分布[8]，而且它在耳蜗内的活性较强，由于金属离子的存在，使超氧阴离子更易接近SOD的活性中心，发生催化反应，达到清除O2-自由基的目的。GSH是细胞内另外一种重要的抗氧化剂，为氧化还原反应提供了大量的还原力。GSH的浓度在血管纹的基底细胞和中间细胞内尤为丰富，在内外毛细胞和支持细胞内有少量存在。而且发现在耳蜗听神经上皮、听神经、外壁组织和血管组织也有GSH和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的表达。

1.3氧自由基与氨基糖苷类药物耳毒性 Park等[9]用庆大霉素氧化花生四烯酸的实验来测定其诱发生成氧自由基的能力，结果发现庆大霉素单独在0.05～10 mmol/L范围内，并不能使花生四烯酸形成过氧化脂质，而在存在铁盐的条件下可生成氧自由基。庆大霉素是一个铁离子的螯合剂，铁离子-庆大霉素复合物的生成是氧自由基产生的催化剂。Zholudeva等[10]用去铁胺和新霉素同时给豚鼠注射，结果发现铁离子螯合剂去铁胺可明显拮抗新霉素的耳毒性。Park等[9]的进一步研究表明，2，3-二羟基苯甲酸盐与甘露醇的联合使用在听功能及形态学指标上可以完全拮抗庆大霉素的耳毒性，氧自由基清除剂和铁离子螯合剂的合用对于庆大霉素血药浓度及其抗菌活性均不影响。当庆大霉素达一定剂量后，庆大霉素会导致耳蜗氧自由基的产生大大超过耳蜗组织的抗氧化能力，使听觉系统发生进行性损害。所以，庆大霉素的耳毒性作用要有一个级联激活过程，这种激活经过一个氧化还原反应，即铁与庆大霉素复合物的形成，可在体外促发氧自由基的产生。庆大霉素与多磷酸肌醇的亲和力也与其耳毒性密切相关。在机体内耳和肾组织中的多磷酸肌醇的含量相对较高，易使庆大霉素与磷脂结合而中毒。而在pH值适合的细胞溶酶体内，聚DL-天冬氨酸的浓度足够时其可从磷脂中置换出庆大霉素，从而可延缓溶酶体磷脂沉积病态发展，抑制溶酶体因为超负荷而破裂使细胞坏死的一系列中毒过程的发生，能起到一定的拮抗作用。水杨酸即邻羟基苯甲酸，可与氧自由基反应生成2,3-二羟基苯甲酸,这是庆大霉素耳毒性的拮抗剂。所以，水杨酸可通过直接和间接的双重作用清除庆大霉素诱发产生的氧自由基,而且作用部位准确。另外的实验研究表明， 川芎嗪也可有效减轻庆大霉素耳毒性损伤[11]，且与川芎嗪具有抗氧化作用有关，对离体鼠耳蜗神经组织分析，得出其为庆大霉素耳毒性拮抗剂[12-13]，但尚不明确其确切的抗氧化机制。

2 细胞凋亡与氨基糖苷类药物耳毒性

2.1细胞凋亡的分子机制 细胞凋亡亦称程序性细胞死亡，是生理状态下发生的细胞自杀过程，在机体中具有重要的生物学意义。随着分子生物学技术的发展，各种研究表明特异性蛋白酶的酶学变化是细胞死亡机制的核心成分，从分子水平看凋亡实质上是蛋白酶一系列级联切割的过程，故抑制蛋白酶活性的因素也就可以抑制凋亡的发生。细胞凋亡是一个很复杂的生理和病理过程，很多因素均可影响细胞凋亡的发生。某些因素可特异性地诱导某种或某类细胞发生凋亡，如某些生长因子依赖性细胞，当撤除生长因子时则发生凋亡；而某些基因的表达产物对细胞凋亡具有明显的促进或抑制作用。细胞凋亡的激发和抑制是受遗传因素影响的，有多种基因参与了细胞凋亡的调节控制。而在细胞凋亡中，并非存在一成不变的代谢途径。细胞凋亡对细胞增殖、器官发生、器官自身平衡的维持有重要意义，是很重要的细胞分子生物学事件。

2.2耳蜗细胞凋亡与氨基糖苷类药物 损伤听力的各种因素，一般均会造成耳蜗毛细胞的损伤，大量毛细胞的急性损伤会破坏感觉上皮结构的完整性，这将对毛细胞损伤后的修复造成很大的影响[14]。细胞凋亡是一个重要过程,其对内耳的正常发育以及去除氧化应激所致的感觉细胞损伤同等重要。AmAn对耳蜗的损伤与耳蜗老化的病理改变很相似。AmAn损伤耳蜗感觉上皮，损伤毛细胞的胞体在上皮内变性，即发生细胞凋亡，这一过程表明毛细胞对组织损伤过程的自我控制和自我保护，与感觉上皮损伤后的修复过程有重要联系。

3 一氧化氮(nitric oxide,NO)与氨基糖苷类药物耳毒性

3.1NO的性质及生物合成 NO是一种无机小分子化合物，在很早就为人们所熟知。近年来对NO的生物学作用取得进一步认识，NO有第二信使和神经递质的功能，故它是一种细胞信息传递的重要载体，广泛参与了各种生理功能的调节。NO的化学性质极不稳定，半衰期很短，仅为5 s左右，而且可被血红蛋白、氧自由基、氢醌等迅速灭活。NO极易与氧发生反应生成NO2-，之后在中性体液中迅速转化为NO3-而丧失其生物学活性，这可能是NO失活的生理机制。上世纪80年代研究发现了硝酸甘油类的扩血管作用来源于其活性代谢产物NO，后又证实中枢神经系统中存在NO作用。

3.2一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的催化作用 NOS是NO生物合成的关键因素，一般NOS可分成神经元型内皮型一氧化碳合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、神经型一氧化氮合酶(nerves of nitric oxide synthase,nNOS)和诱生型一氧化氮合酶(induce nitric oxide synthase，iNOS)。其中nNOS和eNOS依赖于Ca2+/CaM(钙蛋白)，不受内毒素等诱导，统称为原生型酶( constitutive nitric oxide synthase,cNOS)，而iNOS不依赖于Ca2+/CaM，可由内毒素等诱导产生。为阐明NOS的催化过程和调节因子，利用双重聚合酶链反应技术，证明了NOS具有催化L-精氨酸合成NO的活性。NOS蛋白质上有潜在磷酸化位点，因此酶的磷酸化必然影响酶的活力。蛋白激酶A、蛋白激酶G、蛋白激酶Ⅱ、磷酯酶C和磷酯酶A2均参加了NOS的调节过程，有的使酶活力增加，有的使酶活力降低。而且，控制mRNA半衰期是许多因子影响NOS基因表达的共同途径。

3.3NO的生物学作用 NO具有强大的松弛血管平滑肌作用、抑制血小板聚集、神经传导功能、免疫功能及细胞毒性等。NO的细胞毒性作用是非特异性宿主防御反应的组成部分。人体免疫系统的重要成员成纤维细胞、巨噬细胞均可释放内源性NO杀死外来的病原体。另外，NO也在免疫系统中发挥细胞间信息传递的作用。在脑细胞中，NO的小量释放可作为信号分子传递信息，而大量释放时可杀死脑细胞。从耳蜗鼓阶灌注NO供体硝普钠会产生听力损失及耳蜗毛细胞和支持细胞的严重损伤[15-16]。

3.4NO与氨基糖苷类药物耳毒性 Takumida等[17]发现豚鼠螺旋器感觉细胞受到AmAn刺激时会表达iNOS，生成大量的NO，也同时产生大量活性氧，二者对细胞均有破坏作用，而且NO与活性氧发生反应可生成氮的过氧化物，它对细胞也有较强的毒性作用。Inai等[18]证实经静脉给予NOS竞争性抑制剂或NOS的天然底物L-精氨酸，则能降低或提高耳蜗血流。Takumida等[17,19]给豚鼠听泡内注射庆大霉素或生理盐水，即分为实验组和对照组，豚鼠的螺旋器和前庭终器的iNOS采用免疫组织化学的方法检测，豚鼠听泡内先注射N-硝基-L-甲基-精氨酸(即NOS的拮抗剂)和ebselen (氮的过氧化物清除剂)，再给予庆大霉素，形态学结果显示，暴露于庆大霉素的豚鼠螺旋器和前庭器的感觉细胞结构遭到严重破坏，但经N-硝基-L-甲基-精氨酸及ebselen预处理的豚鼠感觉细胞破坏程度较前者轻。

4 耳蜗微循环与氨基糖苷类药物耳毒性

4.1内皮舒张因子与耳蜗微循环 内皮依赖性舒张因子是由血管内皮细胞利用L-精氨酸合成的内源性硝基血管扩张剂,它的实质为NO[20]。在基础状态下,血管内皮细胞持续释放NO,有舒张血管、抗血小板和粒细胞黏附、聚集等作用。如NO合成及作用障碍，较易致血管收缩和形成血栓，导致微循环障碍。内耳微循环非常特殊，与其他脏器微循环具有不同的解剖结构，因而具有不同的剪切应力。耳蜗的弹簧样结构使其血管受到血液流动的切变应力降低，这是促使内皮依赖性舒张因子释放的因素之一。其次在内耳血管壁内皮细胞中含有大量的内皮依赖性舒张因子合成酶，该部位有合成更多内皮依赖性舒张因子的生理基础。

4.2血管纹黑色素与氨基糖苷类药物 研究表明，在人和杂色动物的内耳中分布有黑色素，AmAn作用于内耳后黑色素含量明显增加,证明黑色素与AmAn耳毒性有关[21]。AmAn作用于内耳后，血管纹细胞出现变性改变，如线粒体嵴断裂并肿胀、内质网扩张等，不过黑素体结构并无明显改变，但中间细胞内的黑素体数目明显增多。AmAn的耳毒性与其诱导耳蜗产生自由基有关，黑色素是一种稳定的自由基捕获剂，可防止自由基的损害作用，如自由基造成的细胞DNA链断裂、碱基破坏以及形成DNA-蛋白变联等。通过以上作用，黑色素可减轻AmAn类药物的耳毒性作用。

5 能量代谢与氨基糖苷类药物

耳蜗细胞的正常生理功能有赖于能量的充足供应和细胞内能量代谢的正常进行。三羧酸循环在细胞能量代谢中非常重要，而以琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氨酶为指标，可了解AmAn对糖有氧氧化和糖酵解的作用。实验证明，AmAn可使琥珀酸脱氢酶的活性受到明显抑制，细胞能量代谢降低，细胞的能量供应下降[22]，开始表现为毛细胞功能障碍，后出现毛细胞结构改变。同时，毛细胞内乳酸脱氢酶活性也明显被抑制，该酶活性被抑制的程度以基底周外毛细胞显著，与毛细胞的病理损害过程一致。AmAn中毒后干扰和降低了毛细胞的糖酵解过程，进一步加重了能量供给的不足，使毛细胞内能量代谢出现紊乱。

6 Ca2+与氨基糖苷类药物

近年来对Ca2+的研究表明，Ca2+的生理学功能很重要而且很复杂[7]。Ca2+在细胞膜上是以磷酸肌醇酯和蛋白质相结合的状态存在。AmAn与毛细胞接触首先是与其细胞膜上的磷酸肌醇酯相结合，而当AmAn浓度在一定比例关系时AmAn和Ca2+可以竞争性地与磷酸肌醇酯相结合，也即二者有竞争抑制作用。当AmAn与磷酸肌醇酯结合以后，可以使Ca2+释放出来，这样可以改变细胞膜上的离子通道，导致细胞的死亡。

7 铁离子与氨基糖苷类药物

Ezraty等[5]提出庆大霉素耳毒性可能是由于庆大霉素在体内形成庆大霉素-铁复合物，这个复合物的生成可催化产生自由基而损伤毛细胞。铁螯合剂甲磺酸去铁胺可与铁离子或三价铝离子形成复合物，形成的复合物通过胆汁和尿液可完全排泄，从而可减少铁或铝在器官的病理性沉积。Polony等[4]实验证实，应用甲磺酸去铁胺组听反应阈在实验过程中保持稳定，表明其安全而无毒性；庆大霉素+甲磺酸去铁胺组听反应阈平均较庆大霉素组明显降低，耳蜗毛细胞形态学损伤与听反应阈升高的程度相平行。铁离子提供电子产生羟自由基，是机体内的氧自由基由酶系统和非酶促系统产生某些复合物催化的Haber-Weiss反应的重要环节。

8 氨基糖苷类药物耳毒性的防治进展

AmAn造成耳中毒过程中，自由基的作用非常重要，应用自由基清除剂可拮抗AmAn耳毒性。聚天冬氨酸对庆大霉素所致耳蜗组织自由基的产生有抑制作用，并且随着用药时间的延长这种抑制作用越来越明显，提示聚天冬氨酸对庆大霉素耳毒性拮抗作用与聚天冬氨酸抑制庆大霉素致耳蜗组织自由基的产生密切相关。近期的研究结果发现，内耳毛细胞突触可能是氨基苷类药物耳毒性的作用靶点，为经典的耳聋发病机制的研究和干预策略的制定提供了更新的思路[23-24]。由于NO与AmAn耳毒性的密切关系，可应用NO拮抗剂治疗和预防AmAn耳毒性。在应用药物治疗中，要注意体内NO的水平，在保证其生理作用的前提下，适量减少NO的浓度。联合使用利尿剂等药物以进一步增强药物的耳毒性，因而这种诱导条件下，产生的耳蜗损害常十分严重[25]。N-硝基-L-甲基-精氨酸作为一种NOS的竞争性抑制剂可抑制AmAn的耳毒性，作用机制有待进一步研究。同时，铁离子螯合剂甲磺酸去铁胺等抗氧化剂也有拮抗AmAn耳毒性的作用。水杨酸制剂可以在安全范围内有效预防AmAn耳毒性作用。川芎嗪等中药有活血化瘀、改善内耳微循环等作用，同时作为氧自由基的清除剂，通过对超氧阴离子的清除阻止了细胞脂质过氧化，在预防和治疗AmAn耳毒性中起一定作用。基因治疗是通过直接抑制有害基因的表达,或者通过过表达和插入缺失或下调的基因,直接在靶细胞进行基因操作[26-27]。12S rRNA是线粒体的一个热点突变，近年的研究发现很多与氨基糖苷类抗生素耳毒性相关的12S rRNA突变位点[28-31]，因而基因治疗在氨基糖甙类药物耳毒性的防治中显示出明显的应用前景。

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2017-06-16；

2017-08-07

河北省医学科学研究重点课题(20170085)

何强(1968-)，男，北京人，河北医科大学第二医院副主任医师，医学硕士，从事耳疾病基础与临床研究。

R978.12

A

1007-3205(2017)12-1484-05

许卓文)