自噬在血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞迁移和增殖的作用

侯祥平，陈柳丹，林玉洁，陈克芳，麦华超，陈 珂，李建军

自噬在血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞迁移和增殖的作用

侯祥平，陈柳丹，林玉洁，陈克芳，麦华超，陈 珂，李建军

目的 探讨自噬对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移和增殖的影响。方法 采用体外培养大鼠胸主动脉VSMCs，采用不同浓度AngⅡ(10-10mol/L～10-6mol/L)刺激VSMCs 24 h，免疫印迹检测细胞自噬标志物LC3、Beclin1的表达；采用最佳浓度AngⅡ(10-7mol/L)对VSMCs刺激不同时间点(0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)，同时检测LC3、Beclin1表达。采用AngⅡ1型受体阻断剂(洛沙坦钾)、AngⅡ型受体阻断剂(PD123319)进行预孵，之后采用最佳浓度AngⅡ刺激，检测LC3表达。采用自噬特异性阻断剂3-MA进行预孵，通过损伤愈合试验，CCK8增殖试验检测细胞自噬在AngⅡ诱导的VSMCs迁移和增殖的作用。结果 AngⅡ刺激可引起VSMCs发生自噬，表现为LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1上调，且呈现明显时间、剂量效应(P<0.05)，10-7mol/L AngⅡ刺激24 h自噬最强。AngⅡ1型受体(AT1)阻滞剂(洛沙坦钾)能抑制AngⅡ诱导VSMCs的自噬(P<0.05)，而AngⅡ2型受体(AT2R)阻滞剂(PD123319)不能抑制AngⅡ诱导VSMCs自噬(P>0.05)。自噬特异性阻断剂3-MA能抑制AngⅡ诱导VSMCs的迁移和增殖。结论 AngⅡ可通过AT1R诱导VSMCs发生自噬，从而促进VSMCs迁移和增殖。

血管紧张素Ⅱ；自噬；血管平滑肌细胞；迁移；增殖

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是临床常见疾病，是缺血性心脑血管疾病的主要病理基础，其发病机制尚未完全清楚，临床无特异性药物治疗[1]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖与迁移的异常是引起AS的重要因素[2]。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为肾素-血管紧张素系统(RAS)的主要效应分子可诱导多种炎症因子，促进VSMCs增殖和迁移[3-4]，参与AS的发生和发展过程。选择性血管紧张素-1型受体(AT1)拮抗剂通过阻断AngⅡ与AT1受体结合产生的一系列生物学活性物质，从而抑制AS形成和发展[3]。近年来，自噬在心血管疾病方面研究取得进展。目前研究更多关注自噬与心肌肥厚、心室重构、心肌缺血/再灌注损伤的关系，而在自噬调控血管组成细胞的增殖、分化和转归研究甚少[5-6]。

本研究探讨自噬在AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞迁移和增殖的作用，为探究AngⅡ治疗相关血管疾病提供新策略。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)单克隆抗体(福建迈新生物技术公司)，AngⅡ(Sigma)，PD123319(Sigma)，兔抗人轻链3(LC3)多克隆抗体(美国Sigma)，兔抗人Beclin-1多克隆抗体，兔抗人β-actin多克隆抗体(美国SantaCrus)，3-甲基腺嘌呤(3-MA)(Sigma)，CCK-8试剂盒(碧云天)，增殖细胞核抗原(PCNA)、趋化用微孔滤膜(孔径8 μm，Sigma)。

1.2 大鼠培养及鉴定 健康Wistar大鼠，体重150 g～180 g，断颈法处死后，无菌条件下迅速取下主动脉，游离动脉中层，采用组织贴壁法培养VSMCs。细胞呈VSMCs特征性“峰”“谷”状生长，特异性鼠抗人α-SM-actin免疫组织化学染色证实为VSMCs。实验用生长旺盛的2代～5代VSMCs。

1.3 实验分组 将血管平滑肌细胞随机分组，AngⅡ刺激组：不同浓度AngⅡ(0 mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L)刺激VSMCs 24 h；AngⅡ刺激细胞不同时间组：10-7mol/L AngⅡ分别刺激VSMCs 0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h；3-MA组：5 mmol/L 3-MA预孵育30 min后，加10-7mol/L AngⅡ刺激24 h；洛沙坦钾+AngⅡ组：洛沙坦钾预孵育30 min后，加10-7mol/L AngⅡ刺激24 h；PD123319+AngⅡ组：10-7mol/L PD123319预孵育30 min后，加10-7mol/L AngⅡ刺激24 h。

1.4 自噬标志蛋白(LC3、Beclin-1)表达 采用Western blotting法检测LC3、Beclin-1的表达，各组细胞弃去培养基，预冷的PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤细胞2次，每组细胞加入100 lRIPA裂解液(碧云天)(含1 mmol/L苯甲基磺酰氟)，冰上裂解30 min，4 ℃预冷离心机12 000 r/min离心5 min，收集上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，加入上样缓冲液，100 ℃变性5 min每组取30 g蛋白上样，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，200 mA，30 min将蛋白电转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室温5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗(LC3B 1∶1000，Beclin-1 1∶500， β-actin 1∶500)4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加二抗(HRP标记山羊抗兔IgG 1∶1000)室温孵育1 h，洗涤缓(TBST)洗膜3次，每次5 min，发光液(ECL)显影，凝胶成像系统扫描分析，结果以目的蛋白/内参的灰度比值表示。

1.5 增殖试验 制备实验所需细胞悬液：细胞计数，接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100 μL细胞悬液，同样样本做3个重复。37 ℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2 h～4 h。加入10 μL CCK8：由于每孔加入CCK8量较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或直接配置含10%CCK8的培养基，以换液形式加入。培养1 h～4 h：细胞种类不同，形成的Formazan量也不一样。若显色不够，可继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成Formazan很少，需要较长显色时间(5 h～6 h)。测定450 nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450 nm～490 nm，参比波长600 nm～650 nm。

1.6 迁移试验 细胞生长至80%融汇时减少胎牛血清浓度为0.4%继续培养48 h，使VSMCs生长静止。相应组别用3-MA预处理60 min后将细胞悬液(6×108个/L)加入上室，按不同组别分别与下室中加入AngⅡ、3-MA(总浓度2.4×108个/L)。37 ℃培养6 h后取出滤膜，固定，苏木素染色，镜下计数滤膜下层的细胞(×400)。每张滤膜由同一操作者镜下计数5个相邻视野，相同来源VSMCs制作成4张独立滤膜，均值代表迁移的细胞数(cells/HPF)。不同来源细胞系重复3次。

2 结 果

2.1 AngⅡ诱导VSMCsLC3的表达 采用不同浓度(10-10mol/L～10-6mol/L)AngⅡ分别干预VSMCs 24 h后，通过Western blotting测定自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的变化。在一定范围内随着剂量增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达增加(详见图1A)。在10-7mol/L浓度时达到峰值，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)(详见图1B)。以10-7mol/L AngⅡ为固定浓度刺激血管平滑肌细胞，随着刺激时间延长，LC3-Ⅱ表达逐渐增强(详见图1C)，在24 h达到峰值，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)(详见图1D)。

图1 AngⅡ诱导VSMCsLC3的表达

2.2 AngⅡ诱导VSMCs Beclin-1的表达 以10-7mol/LAngⅡ为固定浓度刺激血管平滑肌细胞，随着刺激时间延长，LC3-Ⅱ表达逐渐增强(详见图2A)，24 h达到峰值，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)(详见图2B)。

图2 AngⅡ诱导血管平滑肌细胞Beclin-1蛋白的表达

2.3 AngⅡ受体(ATIR、AT2R)对AngⅡ诱导VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达 采用AngⅡ 1型受体洛沙坦钾(losartan)预孵育VSMCs 30 min，加入10-7mol/L AngⅡ刺激血管平滑肌细胞后，通过Western blotting法检测自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达。结果显示，AngⅡ可明显增加VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达(P<0.01)；AT1R拮抗剂洛沙坦钾可降低AngⅡ诱导的VSMCs LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达，与AngⅡ刺激组比较，差异有统计学意义(P<0.01)(详见图3)；AT2R拮抗剂PD123319不可降低AngⅡ诱导的VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达，与AngⅡ刺激组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(详见图4)。研究表明，AngⅡ诱导ASMC的自噬是通过ATIR介导实现的。

2.4 自噬抑制剂(3-MA)在AngⅡ诱导VSMCs迁移与增殖中的作用 未经AngⅡ干预的VSMCs在基础状态下也存在着细胞迁移，但迁移细胞数量很少；给予AngⅡ10-7mol/L处理后显著增加VSMCs跨膜迁移细胞数量(P<0.01)，用5 mmol/L 3-MA预孵育VSMCs，跨膜迁移细胞数量未见明显增加(P>0.05)，随后加入10-7mol/L AngⅡ刺激VSMCs 24 h后，与AngⅡ刺激组比较，3-MA抑制AngⅡ诱导血管平滑肌细胞跨膜迁移细胞的数量，迁移细胞显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)(详见图6)。同理，给予10-7mol/L AngⅡ处理后显著增加VSMCs增殖细胞数量(P<0.01)，用5 mmol/L 3-MA预孵育VSMCs，增殖细胞数量未见明显增加(P>0.05)，随后加入10-7mol/L AngⅡ刺激VSMCs 24 h后，与AngⅡ刺激组比较，3-MA抑制AngⅡ诱导血管平滑肌细胞增殖细胞的数量，增殖细胞显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)(详见图7)。表明自噬存在于AngⅡ诱导VSMCs的迁移与增殖，且其自噬抑制剂对AngⅡ诱导VSMCs的迁移与增殖有抑制作用(详见图5)。

图3 洛沙坦钾对AngⅡ诱导VSMCs LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的影响

图4 PD123319对AngⅡ诱导VSMCsLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的影响

图5 苏木素染色图

图6 3-MA在AngⅡ诱导VSMCs迁移的作用

图7 3-MA在AngⅡ诱导VSMCs增殖的作用

3 讨 论

自噬作为维持细胞内环境稳定的重要机制，通过对受损细胞器和老化蛋白质等大分子物质进行降解及再利用，为新蛋白质合成和细胞器更新提供原料，从而维持细胞内环境稳定，如选择性地清除受损的可释放促凋亡因子如细胞色素C的线粒体[7]，但过度自噬会导致自噬性程序性死亡增加。微管相关蛋白1LC3是公认的标记性自噬分子。在自噬发生过程中，LC3-Ⅰ被Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，产生相对分子质量较小的LC3-Ⅱ，并定位到自噬小体中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ变化可用来判断自噬是否被诱导[4]。Beclin-1基因是近十多年来发现与自噬相关的一种抑癌基因，其参与自噬，调节程序性细胞死亡，Beclin-1蛋白是研究自噬的另一个标志性蛋白。

VSMCs是构成血管壁的主要细胞成分之一[4，8]，在动脉粥样硬化形成和发展过程中，VSMCs的增殖与分化起重要作用[9-11]。当出现高血压、动脉粥样硬化、再狭窄等多种血管损伤性疾病时，VSMCs从血管中膜向内膜迁移，并以自分泌、旁分泌形式分泌大量细胞因子和血管活性物质，故VSMCs迁移与增殖是血管病变的细胞基础病理改变之一[12]。AngⅡ作为RAS主要效应分子。血管壁局部生成AngⅡ经血管平滑肌细胞上AngⅡ1型受体(AT1R)直接作用于血管平滑肌细胞，强烈表达生物活性，促进VSMCs增殖和迁移。

本研究发现AngⅡ干预血管平滑肌细胞后出现自噬标志物LC3-Ⅱ向LC3-Ⅰ转化，并呈时间和浓度依赖性，24 h达最高峰，10-7mol/L浓度时达到峰值。Beclin-1在12 h表达上调，24 h达最高峰，提示AngⅡ诱导血管平滑肌细胞发生自噬。AngⅡ通过与细胞膜上特异性受体结合而发挥作用，在人体中以AT1R和AT2R为主，本研究发现AT1R拮抗剂洛沙坦钾可降低AngⅡ诱导VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达，而AT2R则不能，表明AngⅡ诱导VSMCs自噬通过AT1R介导实现的。3-MA是P13K的抑制剂，被广泛用作自噬的抑制剂，本研究发现应用3-MA可抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞迁移与增殖，进一步表明自噬存在于AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞迁移与增殖，自噬抑制剂能抑制AngⅡ诱导VSMCs的迁移与增殖，其自噬可通过AT1R介导调节AngⅡ诱导VSMCs的迁移和增殖，为探究影响自噬药物治疗AngⅡ相关血管疾病提供新策略。

自噬对血管平滑肌细胞的作用是双重的，既可能起到保护作用，又可能起到损伤作用。本课题是在体外细胞水平上研究自噬在血管平滑肌迁移和增殖的作用。本研究证实，AngⅡ可诱导血管平滑肌细胞自噬明显增加，并与时间和浓度呈依赖性。自噬抑制剂3-MA对AngⅡ诱导的VSMCs迁移与增殖有抑制作用。提示自噬可能是AngⅡ诱导VSMCs迁移与增殖的一个作用环节，可能通过调节自噬水平影响动脉粥样硬化的发生发展，其具体分子机制仍需进一步研究和探索。

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(本文编辑薛妮)

中山大学孙逸仙纪念医院(广州 510120)

李建军，E-mail：ljj1965wuan@126.com

R543 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.02.010

1672-1349(2017)02-0161-05

2016-03-22)

引用信息：侯祥平，陈柳丹，林玉洁，等.自噬在血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞迁移和增殖的作用[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(2)：161-165.