健心颗粒对慢性心力衰竭大鼠CaN mRNA、UⅡRNA表达的影响

王 永，施 丹，蔡琦霞，李志朋，李 娥，陈美华

·基础医学论著/研究·

健心颗粒对慢性心力衰竭大鼠CaN mRNA、UⅡRNA表达的影响

王 永，施 丹，蔡琦霞，李志朋，李 娥，陈美华

目的 探讨健心颗粒不同剂量对慢性心力衰竭大鼠钙调神经磷酸酶(CaN) mRNA、尾加压素Ⅱ(UⅡ)RNA表达的影响。方法 将18周龄的自发性高血压大鼠64只随机分为培哚普利组、健心颗粒等剂量组、健心颗粒高剂量组、阴性对照组，每组16只。培哚普利组培哚普利0.36 mg/(kg·d)灌胃、健心颗粒等剂量组、健心颗粒高剂量组分别以健心颗粒3.2 g/(kg·d)、6.1 g/(kg·d)灌胃；阴性对照组予生理盐水，按1 mL/100 g灌胃给药，每日两次。给药后第21天、第35天各组分别处死8只大鼠，采用荧光定量PCR检测心室肌组织CaN mRNA、UⅡRNA表达。结果 第21天与阴性对照组比较，培哚普利组CaN mRNA ，健心颗粒等剂量组、健心颗粒高剂量组大鼠心室肌组织CaN mRNA、UⅡRNA表达均显著下降，且健心颗粒高剂量组明显低于健心颗粒等剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；第35天，与阴性对照组比较，其他各组大鼠心室肌组织CaN mRNA、UⅡRNA的表达均显著下降，且培哚普利组<健心颗粒等剂量组<健心颗粒高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 健心颗粒能减少UⅡ、CaN基因表达，可显著抑制心室重构。

慢性心力衰竭；健心颗粒；自发性高血压大鼠；钙调神经磷酸酶；尾加压素Ⅱ

慢性心力衰竭发生、发展的基本机制是心室重构，是由一系列复杂的分子和细胞机制引起心肌结构、功能和表型[1]的改变。目前已明确交感-肾上腺髓质系统及肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)等神经、体液过度激活引起心室重构，应用β受体阻滞剂及拮抗RAAS药物可延缓心力衰竭进展，但不能完全逆转。研究显示[2-5]，钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)参与诸如血管紧张素Ⅱ、醛固酮、内皮素等多种刺激因素引起的心肌肥大，可致心室重塑。研究表明[6]，尾加压素Ⅱ(UⅡ)可增加细胞内CaN浓度。研究发现[7]，15周龄自发性高血压大鼠(SHR)跟同龄正常血压大鼠(WKY)大鼠比较，血浆及心脏脑钠素(BNP)显著增高，说明已发生心力衰竭。本实验采用18周龄SHR大鼠作为心力衰竭的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 自发性高血压大鼠64只，雄性15周～18周龄，合格证号2007000575411，由福建中医药大学动物实验中心提供。

1.2 实验药物 健心颗粒：黄芪333 g，红参 167 g，丹参 167 g，猪苓 167 g，白术167 g，葶苈子167 g，蒲黄100 g，桂枝100，加水没药浸泡1 h，第2次煎煮1.5 h，第2、3次各煎煮1 h，滤液合并浓缩制成清膏并干燥成颗粒1 000 g，分装，每袋10 g，由福建中医药大学附属第二人民医院制剂室提供，批号：z20100010。培哚普利，每片4 mg[施维雅(天津)制药有限公司生产，批号：H20034053]。

1.3 实验试剂及仪器设备 CaN mRNA、UⅡRNA的Q-PCR试剂盒，购自Vazyme公司。-80 ℃超低温冰箱，型号SANYO MDF-U73V(三洋)，高速冷冻离心机，型号Eppendorf 5417R，德国生产。漩涡震荡仪，型号Eppendorf ThermoMixer C，德国生产。分光光度仪，型号Thermo NanoDrop 2000，美国生产。基因扩增仪，型号Applied Biosystems 9700 PCR System。美国生产。凝胶成像仪，型号Biorad GelDoc XR。水平电泳仪，型号Bio-Rad。荧光定量PCR仪，型号ABI 7500 Real-Time PCR System。

1.4 动物分组及处理 将18周龄的自发性高血压大鼠64只随机分为培哚普利组、健心颗粒等剂量组、健心颗粒高剂量组、阴性对照组，每组16只。参照等效剂量法培哚普利组予培哚普利0.36 mg/(kg·d)灌胃，健心颗粒等剂量组、健心颗粒高剂量组分别予健心颗粒3.2 g/(kg·d)、6.1 g/(kg·d)灌胃，阴性对照组予生理盐水。按1 mL/100 g灌胃给药，每天2次，实验过程35 d。

1.5 实验方法

1.5.1 引物合成 美国life公司合成。其引物序列如下，β-actin引物：上游5’CGGTCAGGTCATCACTATCG’3；下游5’CTGTGTTGGCATAGAGGTCTT’3。CaN引物：CaN上游TATGACGCCTGTATGGATGC；CaN下游：CCTGACTGTGTTGTGAGTGA。引物：UⅡ上游5’GGCAAGATTCTAACACTGTACTGAG’3；下游5’GTTTCCTGAAGTGATGGTTCTGAG’3。

1.5.2 观察指标及方法 分别于灌胃后第21天、第35天每组随机抽取8只大鼠，以水合氯醛麻醉，取心室肌组织100 mg，液氮充分研磨，加入1 mL Trizol(Invitrogen)溶液，匀浆，震荡混匀，室温裂解5 min～15 min，加氯仿0.2 mL震荡混匀，室温放置5 min～15 min，4 ℃12000 r/min离心，15 min，转上层水相(400 μL～500 μL)于另一干净1.5 mL EP管中，加等体积异丙醇(400 μL～500 μL)，混匀后-20 ℃中15 min～30 min，4℃ 12 000 r/min离心，15 min，弃上清，加75%乙醇1 mL，4 ℃ 7 500 r/min离心，5 min，弃上清，超净工作台开风机干燥约30 min，1.1%琼脂糖凝胶，以溴化乙啶染色，凝胶电泳，检测总RNA质量。取1 μg总RNA于PCR管中，65 ℃条件下放置5 min，立即置于冰上至少1 min，进行反转录反应。将反转录CDNA按照以下反应体系进行扩增：RT-qPCR反应体系：2×rTaq PCR SuperMix 10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.8 μL，下游引物(10 μmol/L)0.8 μL，CDNA1 μL，双蒸水7.8 μL，总体积20 μL；反应条件：预变性94 ℃、5 min；变性94 ℃、30 s；退火60 ℃、30 s，30个循环(72 ℃收集荧光)。荧光定量检测，按照上述反应条件制备扩增曲线，ΔCT=同一个组目的基因CT值平均值-内参CT值平均值；ΔΔCT=其他组ΔCT-参考组ΔCT；RQ值=2-ΔΔCT，RQ值代表基因相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠心室肌CaN mRNA表达比较 第21天，与阴性对照组比较，培哚普利组CaN mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；其他两组大鼠心室肌CaN mRNA表达均显著下降，且健心颗粒高剂量组明显低于健心颗粒等剂量组(P<0.05)。第35天，与阴性对照组比较，其他各组大鼠心室肌CaN mRNA的表达均显著下降，且培哚普利组<健心颗粒等剂量组<健心颗粒高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

组别第21天第35天阴性对照组1.17±0.161.11±0.10培哚普利组1.08±0.141)0.89±0.061)健心颗粒等剂量组0.82±0.051)0.42±0.031)2)健心颗粒高剂量组0.52±0.051)3)0.24±0.041)2)3) 与阴性对照组进行比较,1)P<0.05;与培哚普利组比较,2)P<0.05;与健心颗粒等剂量组比较,3)P<0.05。

2.2 各组大鼠心室肌UⅡRNA表达量比较 第21天，与阴性对照组比较，培哚普利组表达差异无统计学意义(P>0.05)，其他两组大鼠心室肌UⅡRNA的表达均显著下降，且健心颗粒高剂量组明显低于健心颗粒等剂量组(P<0.05)；第35天，与阴性对照组比较，其他各组大鼠心室肌UⅡRNA的表达均显著下降，且培哚普利组<健心颗粒等剂量组<健心颗粒高剂量组(P<0.05)。详见表2。

组别第21天第35天阴性对照组0.98±0.030.98±0.02培哚普利组0.92±0.051)0.71±0.071)健心颗粒等剂量组0.64±0.041)0.48±0.011)2)健心颗粒高剂量组0.37±0.041)3)0.25±0.021)2)3) 与阴性对照组进行比较,1)P<0.05;与培哚普利组比较,2)P<0.05;与健心颗粒等剂量组比较,3)P<0.05。

3 讨 论

CaN是迄今唯一受Ca2+/钙调素(CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，其活性由CaM结合CaNA、Ca2+结合CaNB共同调节。CaNB结构与CaM相似。而CaNA分为：CaNAα、CaNAβ、CaNAγ三种亚型，其中参与心肌重构的是CaNAβ[8]。近来研究发现，CaN在心肌重构中发挥重要作用，心肌重构包括细胞重构、组织重构、电重构、功能重构，功能重构是其他三方面改变的外在功能体现[9-10]。心肌肥厚是心室重构的过程之一，主要表现为细胞增大、间质细胞增生、胞外基质重构及胚胎基因再表达，此为心脏在各种体内外刺激因素作用下发生的一种代偿性反应。相关研究发现，CaN可通过调节心肌细胞基因转录阶段，从而参与心肌肥厚形成[11-12]。

UⅡ是一种生长抑素类似的环状血管收缩肽，是目前发现人体最强的缩血管物质[13]，其通过刺激G蛋白偶联受体-UⅡ受体而调节心血管系统。大量研究表明，UⅡ在心肌肥大、心肌纤维化等进程中发挥重要作用，与心室重塑进展密切相关[14]。研究证实[15]，心力衰竭病人血浆UⅡ水平显著高于正常人，且升高与心力衰竭严重程度相关，与心功能分级呈显著正相关，提示血浆UⅡ含量与心力衰竭病情严重程度表现相关。李巍等[16]发现，UⅡ可通过激活CaN通路引起心肌肥大，导致心室重塑。

健心颗粒基于心阳气虚、血瘀水停为主要病理改变而制成，其组方如下：黄芪333 g，红参、丹参、猪苓、白术、葶苈子各167 g，蒲黄、桂枝各100 g。方中以黄芪、红参为君，取其益气温阳之功，以治其本，臣以蒲黄、丹参活血化瘀，疏通血脉，再配以桂枝、猪苓温阳化饮利水，白术健脾燥湿利水，葶苈子宣肺利水。现代药理研究证明，配方红参有大补元气，固脱复脉，有显著强心、扩张冠状动脉的作用；黄芪是中医治疗心气虚证的益气温阳药典型代表，其作用机制与影响心肌肌浆网钙泵基因表达，通过酶实现改善心功能关系密切，且以改善舒张功能为主[17]。现代医学使用利尿药降低前负荷，活血药可扩张血管，改善血液循环，二者合用，减轻心脏前后负荷，从而增加心肌收缩能力，提高心功能，且减慢心率，降低氧耗。而以上诸药相伍，可达到益气活血，温阳利水之功。前期临床研究显示，健心颗粒可明显改善心功能[18]。本研究显示：健心颗粒能减少UⅡ、CaN的基因表达，具有显著抑制心室重构作用，优于培哚普利。

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(本文编辑薛妮)

Effects of Jianxin Granules on the Expressions of Calcineurin mRNA and Urotensin Ⅱ RNA in Rats with Chronic Heart Failure

Wang Yong，Shi Dan，Cai Qixia，Li Zhipeng，Li E，Chen Meihua

The Affiliated Second Hospital，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350001，Fujian，China

Objective To investigate the effects of Jianxin granules (JXG)on the expressions of calcineurin (CaN) mRNA and urotensin Ⅱ (UⅡ) RNA in rats with chronic heart failure (CHF). Methods Sixty-four 18-week-old spontaneously hypertensive rats (SHR) were randomly divided into 4 groups：perindopril group (n=16) intragastric administrated by perindopril 0.36 mg/(kg·d)， JXG low dose group (n=16)intragastric administrated by 3.2 g/(kg·d)， JXG high dose group (n=16) intragastric administrated by JXG 6.4 g/(kg·d)， and negative control group (n=16)given saline solution. After administration of the 21st day， 35th day， 8 rats in each group were sacrificed. The expressions of CaN mRNA and UⅡ RNA were detected by fluorescence quantitative PCR. Results Compared with negative control group，the expressions of CaN mRNA and UⅡ RNA significantly declined at 21st day in JXG groups，which was lower in JXG high dose group than that in JXG low dose group (P<0.05). Compared with negative control group，the expressions of CaN mRNA and UⅡ RNA significantly declined at 35th day in JXG groups and perindopril group，which was lower in JXG groups than that in perindopril group，and was lower in JXG high dose group than that in JXG low dose group (P<0.05). Conclusion JXG can reduce the expressions of CaN mRNA and UⅡ RNA，and inhibit ventricular remodeling in SHR.

chronic heart failure； Jianxin granules； spontaneously hypertensive rats； calcineurin； urotensin Ⅱ

福建省卫生和计划生育委员会中医处课题(No.wzln201304)

福建中医药大学附属第二人民医院(福州 350001)，E-mail：wyong2014@163.com

引用信息：王永，施丹，蔡琦霞，等.健心颗粒对慢性心力衰竭大鼠CaNmRNA、UⅡRNA表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(2)：158-161.

R541.6 R289.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.02.009

1672-1349(2017)02-0158-04

2016-11-25)