大鼠面神经钳夹损伤后蛋白质组学研究*

李伯翰 鄂玲玲 谢 潇 刘洪臣

周围神经损伤的主要原因常见于外伤、产伤、骨发育异常、铅和酒精中毒等引起受该神经支配的区域出现感觉障碍、运动障碍和营养障碍。周围神经损伤后病理生理相当复杂，受损神经再生缓慢且容易与周围组织形成粘连，损伤后可导致神经支配区域功能障碍或丧失，并且患者会承受持续的病理性疼痛，严重影响患者的生活质量。但迄今为止，周围神经压榨或横断后,神经损伤蛋白质微观变化及其与神经再生的关系研究较少,知之甚微。本研究旨在通过蛋白质组学研究，检测面神经钳夹损伤后的大鼠面神经与正常大鼠面神经的差异蛋白。为面神经损伤治疗，提供理论依据。

1.材料与方法

1.1 主要仪器 Eppendorf冷冻离心机(Eppendorf，美国)；IPGhor等电聚焦仪(GE Healthcare，美国)；DYY-6C电泳仪(DYY-6C，中国)；Biotek酶标仪(H4MFPTAD，中国)；ImageMaster 5.0分析软件(天能，中国)；电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.2 主要试剂 Tris饱和酚(索莱宝，中国)；30%丙烯酰胺溶液、尿素、丙基硫酸盐、三羟甲基氨基甲烷、二硫苏糖醇，十二烷基硫酸钠、溴酚蓝、甘氨酸、四甲基乙二胺、苯甲基磺酰氟、碘乙酰胺、乙腈(Bio-Rad公司，美国)；硫脲、甲醇，0.25%硝酸银(北京化学试剂公司)；胰蛋白酶(Sigma，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立及大鼠面神经组织获取健康成年雄性SD大鼠6只，体重300-350g之间，购自解放军总医院第一附属医院动物实验中心，随机分为2组，实验组(面神经钳夹损伤组)和对照组，每组各3只(n=3)。面神经钳夹损伤组手术方法：1%戊巴比妥钠(1mL/300g)全身麻醉后，无菌条件下侧外耳道下作弧形切口,切开皮肤,皮下组织,在咬肌表面筋膜处分离暴露面神经颊支,蚊式血管钳单齿(血管钳单齿宽度约2mm，即损伤长度为2mm)钳夹，持续30秒。即建立大鼠面神经钳夹损伤模型为外周神经损伤研究中的Sunderland II损伤(图1A)。于术后24小时，取损伤部分面神经。对照组：取正常面神经颊支一段。

1.3.2 组织形态学观察 切下包括钳夹伤部位在内的上下各5mm坐骨神经干，随即浸入10%甲醛过夜固定，经酒精梯度脱水后，石蜡包埋，4μm切片，苏木精－伊红(HE)染色，显微镜下观察形态。

1.3.3 大鼠面神经提取及定量 取适量的样本加入0.4mL的蛋白裂解液；超声破碎2秒/次，间隔10秒，共5次，整个操作在冰上进行；冰上静置20分钟。超声破碎物4℃，10000g离心30分钟，取上清转入新管；即我们提取的蛋白液并于-80℃冰箱保存。蛋白裂解液配方：8.0M脲、100mM Tris-HCl(pH 8.0)、1X蛋白酶抑制剂。将最终的蛋白总量递减为 0μg、2.5μg、5μg、10μg、15μg、20μg和25μg，同一个蛋白浓度标准曲线的检测点两个；总体积为25μl。以此将每一分被检测的样本1ul，与24ul水混合；按照比例50∶1混匀BCA试剂，每管加入200μl均匀混合，对比检测酶标板；37℃保温30分钟后室温静置5分钟，肉眼观察是否存在紫色的梯度，如果梯度不明显，终止下一步检测；用酶标仪检测，波长562nm；根据检测结果，生成标准曲线，如果相关性R＜0.90，标准曲线不能用于计算，重新进行实验；根据标准曲线推导出检测蛋白的总量，并计算相应浓度。

1.3.4 质谱分析 第一步：毛细管高效液相色谱，首先将每份样品放入纳升甲醇-HPLC(50102；4L；迪马科技)流速HPLC液相系(ultimate3000，美国)统Ultimate 3000进行分离。配置缓冲液：0.1%甲酸水溶液，0.08%甲酸乙腈水溶液(乙腈占80%)。色谱柱以95%的0.1%甲酸水溶液平衡。样品自动进样到质谱预柱C18 trap column(C18 3mm 0.10×20mm)，再通过分析柱 C18 column(C18 1.9mm 0.15×120mm)分离，流速为600nl/min。第二步，质谱鉴定，经毛细管高效液相色谱分离后的每份样品用Q-Exactive HF质谱仪(Thermo Scientific)进行质谱分析。本实验质谱分析委托北京邦菲生物技术服务有限公司技术人员在国家蛋白质研究中心完成。

1.3.5 数据分析 首先原始质谱数据分析，将RAW文件利用软件Mascot和ProteomeDiscoverer(thermo)进行查库鉴定及定量分析。本次数据分析所选用的数据库为uniprot-rat_160701fasta，Mascot软件版本为Mascot2.1。查库时先将RAW文件通过Proteome Discoverer提交至Mascot服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索分析。

1.3.6 SDS-PAGE电泳 各取蛋白质样品25μg按照5∶1(v/v)加入5X上样缓冲液，沸水浴5min，14000g离心10min取上清，12%SDSPAGE电泳。电泳参数设置：恒流：14mA，电泳时间90min；考马斯亮蓝染色。

1.4 统计学分析 数据用x±s表示，采用SPSS15.0软件对2组蛋白质丰度比较进行t检验。P＜0.05为差异具有显著性。

2.结果

2.1 组织形态学观察 手术过程见图1A，HE染色形态学观察显示，损伤组大鼠面神经损伤区神经纤维较细，相对松散，数目少，排列紊乱、不规则，髓鞘较薄，部分神经纤维未见髓鞘和轴突(图1B、图 1C)。

2.2 电泳结果 蛋白条带清晰，完整，1-3为实验组，4-6为对照组，每一组选取三个重复样本。从上述电泳结果分析，蛋白在14-120kDa范围内得到有效分离。

图1 大鼠坐骨神经染色结果(HE×200)

图2 电泳图

2.3 差异候选蛋白质的MALDI-TOF/TOF分析及数据库查询结果 见附表。

3.讨论

蛋白质组学是在整体水平上研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及变化规律的科学。与传统的生物学研究相比具有快速、灵敏、高通量的优点。蛋白质组学在神经系统中的研究还相对主要集中在中枢神经系统性疾病。然而目前，对于外周神经损伤后修复机制蛋白质组学方面的研究还相对较少，对面神经损伤蛋白质组学相关研究还未见报道。

外周神经损伤后，其再生过程可以分为3个阶段：(1)液体充盈期：外周神经损伤第一天，微环境中营养神经和轴突支持活性的液体充满导管内腔；(2)基质桥(血纤维桥)形成期：持续时间大约为1周，从受损神经两端的成纤维细胞沿基质桥渗透，同时受损神经远端发生Wallerian变性，为轴突再生提供有利的修复微环境；(3)细胞迁移期：雪旺细胞(Schwann-cell)沿基质桥迁移；轴突沿基质桥从近端向远端延伸；2-8周后；雪旺细胞髓鞘化[1,2]。大鼠面神经钳夹损失后，修复过程同样经历如上三个修复时期。本实验中选取Sunderland II类外周神经损伤模型。钳夹损伤后2天后，取面神经做蛋白质组学研究，即外周神经损伤的第二期：基质桥(血纤维桥)形成期。

附表 质谱鉴定的20个差异蛋白质信息表

我们通过蛋白质组学分析钳夹损伤后大鼠面神经和正常大鼠面神经的差异，发现在大鼠面神经损伤后有19个蛋白表达发生显著变化，8个上调蛋白，11个下调蛋白。这些蛋白主要按照功能分类主要参与细胞组成、分子功能和生物过程三部分。在这些蛋白中，结合珠蛋白Haptoglobin简称Hp，Hp的主要存在形式是与红细胞中释出的自由形式存在，并与血红蛋白相结合，每一分子的Hp可以与两分子的Hp不可逆性结合，发生结合作用后，复合物将在几分钟之内迅速转运到肝脏组织，由于肝细胞上的特异性受体，可以有效地结合，并以Hp-Hb复合物进入肝细胞后降解，氨基酸和铁可被机体再利用。因此Hp可以防止Hb从肾丢失而为机体有效地保留铁。结合珠蛋白量的变化可提示肾脏，肝脏心血管等疾病的病理变化[3]。在大脑中枢神经系统中，Hp与游离的Hb结合形成Hp-Hb复合物后科通过亲道夫受体cd163结合，经内吞作用促进Hb清楚，减少Hb相关的毒性反应。Hp缺乏时会使大脑中枢系统损伤恶化，Hp低表达式加剧脑损伤，二HP的过渡表达则减轻脑损伤[4]。本试验研究，钳夹损伤后的面神经中结合珠蛋白上调，提示大鼠面神经损伤后，结合珠蛋白合成增加，对中枢神经及外周神经疾病的诊断及疾病的预后很大帮助。

Tropomyosin原肌球蛋白(TPM)是肌肉收缩过程中一种重要的调节蛋白，以多种异构体形式广泛存在于各种真核细胞中，并完成体内较多生命活动。其所编码的基因突变与多种肌病的发生有关。TPM4基因只能编码一种同源体，即成纤维细胞TPM4，可稳定F-肌动蛋白。在神经系统中被发现与神经轴突的生长和突触可塑性相关，并在未成熟的神经元中调节转录水平，提示TPM4可能参与了神经修复机制[5-7]。本实验中，TMP蛋白上调，启动并参与了神经修复机制，促进损伤后的面神经轴突生长和突触可塑性增强。

Neurofilament神经丝蛋白属于复杂的中间丝蛋白多基因家族成员，是神经元特异蛋白和细胞骨架的主要成分，在成熟的轴突中提供弹性使神经纤维易于伸展和防止断裂，起着进行性稳定细胞骨架的作用，主要存在于大直径的有髓神经纤维中。由三种特定的蛋白亚基(NF-L，NF-M，NL-H)组装而成。三种类型的亚单位均含有一个有310氨基酸的螺旋杆状区，一个球形的氨基(N-)头端及羧基(C-)端侧壁投射是神经细胞骨架的主要成分，占蛋白重量的80%以上。本实验中Neurofilament面神经损伤后该蛋白下调，即有髓神经纤维Neurofilament蛋白降低轴突断裂，细胞骨架稳定功能降低。

Periaxin蛋白位于雪旺细胞中并特异性表达的支架蛋白。雪旺细胞包裹轴突形成髓鞘过程中，Periaxin蛋白的主要作用是：调节髓鞘的延展长度与修复受损髓鞘、改变调节轴突直径大小并及时传递细胞内外信号。Puentes报道Periaxin蛋白的缺失或突变,将破坏外周神经系统中神经纤维的聚集,从而引发脱髓鞘型腓骨肌萎缩症发生。还可作为成纤维细胞膜的骨架蛋白,在跨膜信号传递、营养物质输送等过程中发挥作用。Periaxin蛋白编码两种长短不同的periaxin蛋白：L-periaxin亚蛋白和S-periaxin亚蛋白。L-periaxin包含4个结构域：N端PDZ结构域、核定位信NLS结构域、重复区域以及C端酸性区域；S-periaxin只包含PDZ结构域[8]。

Periaxin蛋白参与周围神经纤维和细胞支架作用的蛋白，参与并调控周围神经纤维发育的早期阶段。Periaxin蛋白参与雪旺细胞外周神经系统髓鞘化表达，但是该蛋白在中枢神经的轴突神经胶质细胞不表达，也未整合到致密的髓鞘中。1995年Scherer等[9,10]研究发现，在外周神经的发育过程中，periaxin蛋白主要起到重新定位亚细胞的作用，在髓鞘未成熟期，该蛋白主要集中在近轴突膜处，而在髓鞘成熟期，该蛋白相对集中于质膜处而远离轴突膜。我们可以从periaxin的分布、结构与功能开展研究,寻找与其相互作用的蛋白质并揭示其互作的生物学意义,从蛋白质水平上研究周围神经的发病机制具有重要意义。

面神经损伤是口腔颌面外科的常见病,患者会出现口眼歪斜、患侧面部麻木、眼睑闭合不全、面部表情功能减弱。严重影响患者面部功能、社会功能和心理健康。虽然修复面神经损伤的方法多种多样,但修复的效果并不理想，常伴有面肌痉挛、联带运动等并发症。本研究通过蛋白质组学面神经钳夹损伤大鼠面神经与正常大鼠面神经组织的差异蛋白质，发现面神经损伤大鼠面神经组织存在的自身缺陷，为面神经损伤术后治疗提供研究的新靶点。

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