金草片微生物限度检查方法的适用性研究

于世海,胡佳,马丽

1.辽宁康辰药业有限公司,辽宁丹东 118300;2.锦州药品检验检测中心,辽宁锦州 121000;3.丹东宏业制药有限公司,辽宁丹东 118300

金草片由筋骨草提取制成,具有清热解毒,凉血消癥的功效,中医辨证为瘀毒内结证,症见:下腹胀痛或刺痛,腰骶疼痛,低热起伏,神疲乏力,带下量多,小便黄赤,大便干结,舌质红或暗红,边尖瘀点或瘀斑,苔黄腻或白腻,脉弦滑或滑数。依据2015年《中国药典》中规定[1],在检查药品内微生物限度时,仅在检验条件下,缺乏样品浓度对污染微生物抑制生长时,才可真实反映出试品种微生物,进而确保检验结果的准确性和科学性[2]。针对存在抑菌作用的种类,需给予相应措施,如薄膜过滤法、离心沉淀法、培养基稀释法,或任意两种方式联合使用,将抑菌作用消除后,再检验,进而确保方法可靠性[3-4]。

1 材料与设备

1.1 材料

金草片试验菌:枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)、黑曲霉(C M C C(F)9 8 0 0 3)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)、大肠埃希菌(CMCC(B)44102)、白色念珠菌(CMCC(F)98001),以上菌种均由中国食品药品检定研究院提供。

培养基:PH7.0氯化钠-蛋白胨(批号:160801);胰酪大豆胨琼脂(TSA)(批号:160819);胰酪大豆胨肉汤(TSB)(批号:160712);沙氏葡萄糖琼脂(SDA)(批号:160825);麦康凯肉汤(批号:160801);麦康凯琼脂(批号:160303);以上培养基均由北京三药科技开发有限公司提供。

1.2 仪器设备:

隔水式电热恒温培养箱: 303A-2型上海科学仪器有限公司

隔水式电热恒温培养箱:GHP-9160型上海一恒科学仪器有限公司;霉菌培养箱:MJ-150I型上海一恒科技有限公司;霉菌培养箱:MJ-150-I型上海一恒科学仪器有限公司;压力蒸汽灭菌器:LDZX-30KBS型上海申安医疗器械厂;天平:HC-TP11B·5 型北京医用天平厂。

2 方法

2.1 菌液制备

试验菌株:检查需氧菌总数所用菌株为枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、白色念珠菌。检查霉菌和酵母菌的所用菌株为黑曲霉、白色念珠菌,控制菌检查验证菌株为乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌,试验菌株传代次数＜5代,并用菌种保藏方式保存,确保试验菌株生物特性。

①检查需氧菌总数,制备酵母菌和霉菌检查方式验证:分别接种枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体10 mL培养基内,在30～35℃环境下培养18～24 h,取1 mL培养液加入到9 mL无菌氯化钠溶液0.9%,用10倍递增稀释法将其稀释到103～104cfu/mL,留置备用。

②将白色念珠菌新鲜培养到培养到沙氏葡萄糖液体培养基10 mL内,在23℃环境下培养24～48 h,取10 mL此培养液加入到加含0.05%(mL/mL)吐温80的0.9%无菌NaCl溶液5 mL,洗下霉菌孢子,取出1mL霉菌孢子悬液加0.9%无菌NaCl溶液9mL,稀释至霉菌数约为103～104cfu/mL。

③将黑曲霉新鲜培养物培养到沙氏葡萄糖琼脂斜面,在23℃环境下培养7d左右,直至得到丰富孢子,将其加入5 mL含0.05%(mL/mL)吐温80的0.9%无菌NaCl溶液洗下霉菌孢子,洗脱孢子,将其吸入到无菌试管内,取1 mL加入到聚山梨酯80 0.05%的9 mL无菌NaCl溶液0.9%中,用10倍递增法进行稀释处理,将其稀释到10～5～10～7,制备为孢子菌悬液103～104cfu/mL,放置备用。

将所制备的菌液放置在室温下,需在2 h内使用,保存在6℃环境下,可24 h内使用。将黑曲霉孢子悬液保存在6℃左右的环境下,此需在储存期中使用。

验证过程中,需逐一验证各试验菌回收率。验证需氧均总数用常规倾注平皿法,霉菌和酵母菌检查方法用常规倾注平皿法进行测定。

2.2 供试液制备

称取供试品约为10 g,加入100 mL pH7.0无菌NaCl-蛋白胨缓冲液,制成稀释比为1:10的供试液。取1:10供试液作为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌试验检查的供试液,备用。

2.3 计数方法适用性试验

2.3.1 试验组 ①需氧菌总数计数:取1:10供试液9.9 mL5份,分别加入5种试验菌0.1 mL(约含104 cfu/mL),混匀。分别吸取1 mL注入平皿,倾注胰酪大豆琼脂培养基,按常规平皿法测定需氧菌的菌落数。②霉菌和酵母菌总数计数:取1:10供试液9.9 mL2份,分别加入2种试验菌0.1 mL(约含104 cfu/mL),混匀。分别吸取1 mL注入平皿,倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基,按常规平皿法测定霉菌和酵母菌的菌落数。

2.3.2 菌液组 以稀释液替代供试液。取稀释液9.9 mL,每份加入与试验组相同的试验菌0.1 mL(约含104cfu/mL),混匀。分别取1 mL注入平皿,倾注琼脂培养基,按平皿法测定菌落数。

2.3.3 供试品对照组 取供试液,以稀释液代替菌液同试验组操作。

2.3.4 微生物的回收率 回收率=[(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)÷菌液组的菌落数]×100%

2.4 控制菌检查方法

①大肠埃希菌取1:10供试液10 mL,加入到100 mL胰酪大豆液体培养基中,再向其中加入小于100 cfu的试验菌,依《中国药典》2015版相应控制菌检查法进行检查。

②控制菌采用常规法进行大肠埃希菌的检测,大肠埃希菌阳性对照菌检出。

3 结果

根据方法适用性试验结果确定,金草片微生物限度检查法如下:

3.1 需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数

在3次平行试验中(确保独立),人为的污染金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉、白色念珠菌的试验组的菌回收率均在0.5～2.0范围内。最终确定取1:10的供试品溶液,采用倾注平皿法。

3.2 控制菌:

3.2.1 大肠埃希菌:采用常规法检验。即取1:10供试液10 mL,加入至100 mL胰酪大豆液体培养基培养基中,培养。

4 讨论

因中成药成分具有多种性,任何成分均具备抑菌功效,均可能对微生物限度检查准确性造成影响,常规方式可用在抑菌作用弱或无抑菌功效的药物,而较强抑菌作用的药物,可用培养基稀释法降低药品内抑菌成分指数,进而消除对酵母菌、霉菌、细菌的生长影响。所以,在检查药品微生物限度前,需将自身抑菌干扰性排除,确保所测结果的有效性和可靠性[5]。中成药金草片由筋骨草提取制成,虽然明显抑制菌类生长[6],但是常规检验量1mL对微生物限度检验没有抑菌作用,故采用常规倾注法。所以,在检查中成药微生物限度之前,需进行必要的成分分析,存在相应参考价值。综上,中成药金草片可采用微生物限度方式进行检验,可应用性极大,值得推广。

[1]国家药典委员会.《中国药典》2015年版四部[M].中国医药科技出版社

[2]张萍,刘艳玲.小柴胡颗粒微生物限度检查方法学研究[J].内蒙古中医药,2014,33(13):98-99.

[3]赵会兰.20种中成药微生物限度检查方法验证[J].中国执业药师,2014(2):21-24.

[4]张美丽,杨晓东,邓媛等.中成药微生物限度检查方法验证[J].河南中医,2014,34(3):532-534.

[5]张裕民,张纯溪.不同厂家生产的消炎片微生物限度检查结果分析[J].中国药事,2016,30(5):477-481.

[6]赵会兰.15种中成药微生物限度检查方法验证[J].中国执业药师,2014(5):17-20.