MicroflexTM MALDI-TOF MS全自动微生物分析系统对肠杆菌科细菌的鉴定能力评估

夏金玲 沈阳市康平县人民医院检验科 （辽宁 沈阳 110500）

Microflex MALDI-TOF MS全自动微生物分析系统对肠杆菌科细菌的鉴定能力评估

夏金玲 沈阳市康平县人民医院检验科 （辽宁 沈阳 110500）

目的：分析Microflex™MALDI-TOF MS全自动微生物分析系统对肠杆菌科细菌的鉴定能力。方法：选择500株肠杆菌科质控菌株与临床分离菌株作为检测标本，分别进行Microflex™MALDI-TOF MS与Vitek 2 Compact菌株鉴定，对两组方案的检测结果进行分析统计。结果：Microfex™MALDI-TOF MS对细菌种、属的鉴定率分别为97.00%（485/500）与3.00%（15/500），Vitek 2 Compact对细胞种、群、属的鉴定率分别为83.20%（416/500）、14.20%（71/500）、2.60%（13/500），比较两组方式的鉴定符合率差异显著（P＜0.05）。结论：对肠杆菌科细胞采取Microfex™MALDI-TOF MS鉴定方式的符合率明显高于Vitek 2 Compact鉴定方式，具有成本低、操作简便、快速等优势，建议在医学微生物检验中推广应用。

全自动微生物分析系统 微生物检测 肠杆菌科细菌

近些年来，革兰阴性杆菌在临床微生物的样本中分离率已经超过70%[1]，其中33%左右为肠杆菌科细菌[2]，该类细菌与人类之间的关系密切。近些年来，随着临床医学技术、免疫抑制剂等的快速发展，导致医院感染事件的发生率与日俱增（肠杆菌科细胞导致），因此，对感染性疾病积极进行临床诊断与治疗的意义重大。本次研究对肠杆菌科细菌采取Microfex™MALDI-TOF MS全自动微生物分析系统鉴定方式，可达到较为显著的应用效果。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选择500株肠杆菌科质控菌株与临床分离菌株作为检测标本，所有检测标本均由本地临床检验中心2015年1月～2015年12月各类样本分离得来。

1.2 方法

选择实验仪器与试剂类型包括：Vitek 2 Compact与配套的革兰阴性杆菌鉴定卡、Microflex™MALDI-TOF MS检测仪与α-氰基-4-羟基肉桂酸、Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler聚合酶链反应、ABI Prism 310 CeneticAnalyzer DNA测序仪、PCR扩增试剂盒与DNA胶回收试剂盒、Test Standard（BTS）、三氟乙酸、乙醇、甲酸、沙门菌属诊断血清等。

Vitek 2 Compact鉴定：严格挑选纯菌落（平板上），准备好菌悬液（浓度为0.5麦氏单位），给予Vitek 2 Compact与配套的鉴定板完成操作。

MALDI-TOF MS仪的鉴定：切换为线性操作工作模式，选择基质抑制偏转模式。提取脉冲离子（100ns），2000～20000为相对分子质量。选择待测样本，将去离子水与乙醇加入，含量分别为300μL与μL，充分将其混匀后离心操作，之后进行干燥沉淀处理，将1～80μL的甲酸水溶液（70%）兑入，并摇匀，之后加入等量的乙腈，并混匀，连续离心2min之后选取1μL的上清液，滴入MALDI靶板内并晾干（室温状态下），将α-氰基-4-羟基肉桂酸基质液（含量为1μL）对上述样本点严格进行覆盖，并在室温下晾干处理。之后进行质谱分析，将上述实验数据纳入数据库中进行处理，若检测得知评分≥1.7则说明检测的样本图谱与数据库中相匹配的图谱高度具有一定的相似性。

血清凝集：严格依照《全国临床检验操作规程》（第3版）中对沙门菌血清凝集试验中的操作方案进行。

测序基因：提取细菌基因组的DNA（选用水煮法），检测模板为细菌基因组DNA，之后采取PCR扩增处理，采取细菌16S核糖体进行操作，严格依照试剂说明书上的内容进行PCR体系配置。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳处理后，将DNA条带琼脂凝胶块进行割取，并采用DNA胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，之后测序DNA序列，将检测得知的DNA序列与BLAST工具比较，由此获取菌株类别。

1.3 评价指标

对比两组鉴定方法的符合率。

1.4 统计学处理

采取SPSS18.0的统计学软件纳入本文检测所需数据，计数资料采用χ2检验，结果用率表示，检验水准α=0.05，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

Microflex™MALDI-TOF MS对细菌种、属的鉴定率分别为97.00%（485/500） 与3.00%（15/500），Vitek 2 Compact对细胞种、群、属的鉴定率分别为83.20%（416/500）、14.20%（71/500）、2.60%（13/500），比较两组方式的鉴定符合率差异显著（P＜0.05）。

3.讨论

肠杆菌科细菌在临床上称之为一类感染病原菌[3]，分布范围十分广泛，较为多见，可引发肺炎、伤口感染、血流感染等不良情况，受到医学工作者的广泛关注。以往临床上对肠杆菌科细菌主要采取手工板条法与仪器法进行鉴定，其中仪器法中最常见的为Vitek 2 Compact，均是依据细菌生化反应的结果进行判定的，存在较高的成本且检测时间较长，Microflex™MALDI-TOF MS技术属于一类近些年来新兴的对微生物进行检测的方案，已经在微生物领域中得到了广泛的推广。

本次研究对500株肠杆菌科细菌分别采取Microflex™MALDI-TOF MS与Vitek 2 Compact进行菌株鉴定，并对于结果不符的菌株采取沙门菌血清凝集试验再次进行确认，并对两种不同的检测方式鉴定符合率进行比较可知，其差异具有一定的统计学意义。其中Vitek 2 Compact数据库中由于阴沟肠杆菌等属于复合群，普通变形杆菌与潘氏变形杆菌属于同一个复合群，将往往使得上述细菌鉴定程度只能到群，在数据库等因素的影响下，容易导致分散的泛菌鉴定程度只能到群，分散的泛菌鉴定程度往往只能到属。

Microflex™MALDI-TOF MS数据库中的肠杆菌科细菌参考图谱与Vitek 2 Compact相比，前者图谱种类往往更多，导致前者对于上述细菌可鉴定至种，对沙门菌株进行鉴定时，采取前者鉴定方式对于肠炎沙门菌、猪霍乱沙门菌可鉴定至种，而后者可对伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌鉴定至种，而采取Vitek 2 Compact检测技术对大肠埃希菌进行鉴定可知，少量的菌属未能够进行有效的鉴定，可能是由于菌落黏膜感较强，对较为均匀的菌悬液准备存在一定的难度，从而直接对鉴定结果造成一定的影响[4]。

综上情况可知，对肠杆菌科细胞采取Microflex™MALDI-TOF MS鉴定方式的符合率明显高于Vitek 2 Compact鉴定方式，具有成本低、操作简便、快速等优势，建议在医学微生物检验中推广应用。

[1] 冯旭慧,袁春儿,陈捷,等.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的临床分布及耐药性[J].中国微生态学杂志,2016,28(3):312-315.

[2] 刘萍,闫雪苗,张坚磊,等.23株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因分析[J].山东医药,2016,56(24):91-93.

[3] 李军,邹明祥,王海晨,等.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药机制的研究[J].中华医院感染学杂志,2016,26(21):4801-4804.

[4] 魏雪,黄红兵,刘韬,等.结直肠肿瘤患者手术分离易感菌株的药物敏感性分析[J].中国医院用药评价与分析,2014,14(2):139-141.

1006-6586(2017)12-0035-02

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2017-03-15