不同方法制备黄芩苷及其镁盐体外抑菌实验

刘一鑫，薛禾菲，许海舰，刘喜纲，刘翠哲

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，承德 067000)

实验研究

不同方法制备黄芩苷及其镁盐体外抑菌实验

刘一鑫，薛禾菲，许海舰，刘喜纲，刘翠哲*

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，承德 067000)

目的：比较三种不同方法制备的黄芩苷及其镁盐的体外抑菌效果。方法：采用纸片扩散法观察不同方法制备的黄芩苷及其镁盐对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的体外抑菌效果。结果：合成法制备的黄芩苷镁盐对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，不加酸提取精制法制备的黄芩苷镁盐对绿脓杆菌的抑制作用较强，黄芩苷及其镁盐对大肠埃希菌的抑制作用均较弱。结论：不同方法制备的黄芩苷及其镁盐对三种耐药性细菌均有一定程度的抑制作用。

黄芩苷，黄芩苷镁盐，体外抑菌

黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)为唇形科植物黄芩的干燥根，又名黄金茶、空心草、山茶根[1]。本品味苦，性寒，归肺、胆、脾、胃、大肠、小肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、凉血止血、安胎的功效[2]。黄芩苷是黄芩中的一种黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗过敏、抗氧化、解热和清除自由基等多种药理作用[3]。2015年版《中国药典》载录的黄芩药材规定含有黄芩苷的量不得少于8%，载录的黄芩提取物项下含有黄芩苷的含量不得少于85.0%[4]。目前黄芩多以黄芩苷作为主要有效成分入药，临床应用十分广泛。

《中国药典》载录的黄芩苷是通过黄芩药材水提酸沉纯化法得到，目前市场上出售的黄芩苷，均是此方法提取得到。但此方法提取得到的黄芩苷几乎不溶于水，口服生物利用度低[5]。而黄芩苷在黄芩中的原本存在形式是镁盐形式，这种形式的水溶性很好，可以通过水溶解的方法提取得到。但《中国药典》方法加酸后破坏了黄芩苷的原本存在形式，使黄芩苷的水溶性变差，吸收速度慢，生物利用度低。本课题组经过前期研究，在不改变黄芩中黄芩苷的原本存在形式基础上，采用不加酸提取精制的方法，从黄芩中提取出黄芩苷镁盐；同时也发明了以《中国药典》方法提取得到的黄芩苷为原料，合成黄芩苷镁盐的方法，还原了黄芩苷在黄芩中的存在形式。经过四大光谱检测验证，可以确定黄芩苷和黄芩苷镁盐为相同结构，并且已经申请国家发明专利。本文对这三种方法制备的黄芩苷及其镁盐的体外抑菌效果做了以下研究，比较三种样品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌三种耐药性细菌的抑制作用强弱，为筛选较好的黄芩苷及其镁盐的临床用药提供依据。

1 实验材料

1.1 药物 黄芩苷对照品(含量为98%，购自中国食品药品检定研究院，批号110715-201318)；《中国药典》方法制备的黄芩苷(含量为72%，本实验室自制)；合成方法制备的黄芩苷镁盐(含量为72%，本实验室自制)；不加酸提取精制方法制备的黄芩苷镁盐(含量为51%，本实验室自制)。

1.2 仪器 安捷伦1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；旋转蒸发仪(北京五洲东方科技有限公司)；AG-245型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ2200D型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；YXQ-LS-SⅡ型电热压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司)；HZQ-C气浴恒温振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；GHX-9080B型隔水式恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)；pHS-3C型酸度计(上海伟业仪器厂)。

1.3 菌株 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌，均购自上海鲁微科技有限公司(三种细菌均为第2代菌种，菌种使用5代后弃置)。

1.4 试剂 牛肉膏、营养琼脂粉、酵母、蛋白胨和氯化钠均购自北京索来宝生物科技有限公司；蒸馏水(本实验室自制)；大孔吸附树脂(HPD-100型)。

2 实验方法

2.1 三种黄芩苷及其镁盐的制备方法

2.1.1 《中国药典》方法制备黄芩苷(样品一) 取黄芩药材适量，加水煎煮，合并水煎液，浓缩水煎液至适量，用盐酸调节pH值为1.0～2.0，80 ℃保温，静置，滤过，沉淀物加适量水搅匀，然后用40%氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，加等量乙醇溶液，搅拌使之溶解，滤过，滤液用盐酸调节pH值至1.0～2.0，60 ℃保温，静置，滤过，沉淀物依次用适量水及不同浓度的乙醇溶液洗至pH值为7.0，挥干乙醇溶液，减压干燥，即得[4]。

2.1.2 不加酸提取精制法制备黄芩苷镁盐(样品二) 取黄芩药材100 g，加入1 000 ml 50%乙醇溶液，水浴加热到60 ℃进行提取2次，每次1 h，合并提取液，回收乙醇，得到适量浓缩液，并过处理好的HPD-100型大孔吸附树脂柱进行吸附，用5 BV的蒸馏水洗去杂质，再用5 BV的50%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液(5 BV)，减压浓缩，冷冻干燥，即得。大孔吸附树脂预处理方法：将大孔吸附树脂在浓度为95%的乙醇溶液中浸泡20 h，湿法装柱，然后用浓度为95%的乙醇水溶液以1.5 BV/h流速通过该大孔吸附树脂柱，直到流出液与水按照体积比为1∶5混合后不再呈现白色浑浊状，用蒸馏水以1.5 BV/h流速洗脱，将液体洗脱至无色[6]。

2.1.3 合成法制备黄芩苷镁盐(样品三) 称取样品一 5 g，置于圆底烧瓶中，加入125 ml纯化水，使黄芩苷呈混悬液状态；精密称取氢氧化镁0.16 g，加入黄芩苷混悬液中，在60 ℃条件下充分搅拌使其混合均匀，反应4 h，溶液由浑浊逐渐变为暗红色，最后得到溶液的颜色澄清透明；将反应液滤过，取滤液，冷冻干燥，即得。

2.2 黄芩苷及其镁盐的紫外吸收光谱和红外吸收光谱分析 本研究将黄芩苷与黄芩苷镁盐在200～400 nm下仪器自动扫描紫外吸收光谱，检测结果见图1。黄芩苷与黄芩苷镁盐的紫外最大吸收波长(λmax)相同，均在216、276与317 nm处有最大吸收。本研究采用常规溴化钾压片法测定红外吸收光谱，于红外光谱仪上500～4 000 cm-1处，分别对黄芩苷和黄芩苷镁化合物进行红外吸收光谱扫描，红外吸收光谱扫描结果见图2-图4。分析结果如下：通常C=O吸收峰位于1 850～1 600 cm-1，在黄芩苷红外光谱中，葡萄糖醛酸上的羰基吸收峰位于1 727 cm-1，在形成化合物后该峰消失。1 660 cm-1为4位C=O吸收峰，1 202 cm-1为5位C-O的伸缩振动吸收峰，在形成化合物后无明显变化，位于1 600～1 400 cm-1的苯环骨架吸收峰也无变化，这说明反应产物对苯环共轭体系无影响。通过对黄芩苷和黄芩苷镁红外光谱主要特征峰的比较分析，说明黄芩苷与Mg2+在葡萄糖醛酸上的羧基发生反应。

图1 紫外吸收光谱检测黄芩苷和黄芩苷镁盐

图2 红外吸收光谱检测黄芩苷

图3 红外吸收光谱检测黄芩苷镁盐(提取方法得到)

图4 红外吸收光谱检测黄芩苷镁盐(合成方法得到)

2.3 黄芩苷及其镁盐的含量测定

2.3.1 色谱条件 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)为流动相；检测波长为:280 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μl；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2 500。

2.3.2 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含有60 μg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取黄芩苷及其镁盐约10 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加甲醇溶液适量使之溶解，再加甲醇溶液至刻度，摇匀。精密量取5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入HPLC中，测定，即可(黄芩苷镁盐含量以黄芩苷计)，结果见表1。

表1 不同方法制备的黄芩苷及其镁盐的含量

2.4 体外抑菌试验 根据徐淑云编写的《药理实验方法学》(第三版)，第63章中抗菌药物实验法，进行体外抑菌实验。

2.4.1 液体培养基的制备 精密称取牛肉膏2 g、酵母3 g、氯化钠5 g、蒸馏水700 ml混合，调节液体培养基的pH值为7.0左右，在蒸汽灭菌锅里高压灭菌30 min，温度调至120 ℃，灭菌完毕后取出，分别放入6个锥形瓶中，每一个锥形瓶中液体培养基的体积为100 ml，密封好，备用[7]。

2.4.2 药液的制备 精密称取样品一和样品三各13.9 mg，加蒸馏水定容至10 ml；精密称取样品二 19.6 mg，加蒸馏水定容至10 ml。使药液的浓度均为1 g/ml，高压灭菌30 min，温度调至120 ℃，灭菌后冷藏备用。

2.4.3 菌液的制备 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌三种第二代细菌从营养琼脂斜面上分别挑取一接种环的量，接种到三个带有液体培养基的锥形瓶中，轻轻摇晃锥形瓶后，放置在气浴恒温振荡器中，温度调节至37 ℃，培养24～48 h后，观察液体变浑浊，即细菌复活成功。

2.4.4 固体培养基的制备 取另外三个带有液体培养基的锥形瓶，每瓶分别加入琼脂粉5 g，轻轻摇匀，放置在蒸汽灭菌锅里高压灭菌30 min，温度调节至120 ℃，倾入培养皿，使液体均匀分散在培养皿中，冷却3～5 min，变为固态，即可使用。

2.4.5 纸片扩散法 实验前，用紫外灯消毒实验室30 min。在无菌操作条件下，用无菌接种环(接种环在酒精灯上灼烧，颜色变红即可)分别挑取三种目标菌液单菌落，用平板划线法在固体培养基表面分别均匀涂布3次，每种细菌平行涂布两个培养皿，室温干燥3～5 min后，滴加20 μl黄芩苷药液(1 g/ml)在0.5 cm直径的滤纸片上；阴性对照滴加20 μl蒸馏水在0.5 cm直径的滤纸片上。将滤纸片完全贴到培养基上，阴性对照的滤纸片贴到培养基中心。再次放入恒温培养箱中培养18～24 h，观察有无抑菌圈[8]。

2.4.6 抑菌效果评价 由于《中国药典》中没有明确关于中药抑制细菌的效果评价指标，因此本试验只能通过精确测量抑菌圈的直径，根据抑菌圈的大小对样品的抑菌效果进行评价，3次重复实验均有抑菌效果，视为抑菌作用有效。

3 结果

根据测量抑菌圈直径，确定三种不同方法制备的黄芩苷及其镁盐对三种耐药性细菌均有一定的抑制作用。通过对比抑菌圈直径得出结果:合成方法制备的黄芩苷镁盐对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强；提取精制方法制备的黄芩苷镁盐对绿脓杆菌的抑制作用较强；但三者对大肠杆菌的抑制作用均不是很明显。阴性对照蒸馏水组对三种细菌均没有抑菌效果，结果见表2。

表2 不同方法制备的黄芩苷及其镁盐的抑菌效果

4 讨论

根据表2可知，黄芩苷镁盐的抑制细菌效果比黄芩苷好。合成方法制备的黄芩苷镁盐和不加酸提取精制方法制备的黄芩苷镁盐在同等剂量下，前者抑制细菌效果更好，推测可能是由于制备方法不同，其杂质对抑菌效果有无影响还未可知，需要继续探究。

耐药性细菌的出现，增加了感染性疾病治愈的难度，在西药效果不佳的情况下，迫使人们寻找新的对抗微生物感染的方法，纷纷将目光投向中药对细菌的抑制作用。黄芩是临床常用中药，现代研究结果表明，黄芩及其有效成分黄芩苷具有较强的抗菌作用和较广的抗菌谱，有着巨大的应用价值和开发前景，值得深入研究[9]。本实验证明了黄芩苷及其镁盐对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌三种耐药性细菌的体外抑制作用，黄芩苷镁盐的抑菌效果明显高于黄芩苷，为后续研究黄芩苷镁盐抑制细菌和其他致病菌提供了实验基础。

1 文敏,李雪,付守廷. 黄芩苷药理作用研究新进展[J].沈阳药科大学学报, 2008,25(2):158-161

2 付国辉,马香芹.黄芩的化学成分及药理作用研究进展[J].中国当代医药,2015,22(22):18-20

3 张有志,王美玲,李存保.黄芩提取物抑菌实验研究[J].内蒙古医科大学学报,2014,S1:171-176

4 中国药典[S].一部.2015：282,391,457-458

5 王春民,刘刚,费艳,等.大孔吸附树脂法纯化黄芩总黄酮工艺的研究[J].中草药,2010,4(1): 58-606 袁媛.黑参中人参皂苷的大孔吸附树脂纯化工艺研究[J].亚太传统医药, 2016,12(5):41-43

7 孙冬梅,祁枣园,李岩,等.黄芩苷对耐药性金黄色葡萄球菌的抑菌作用研究[J].吉林医学, 2011,32(13):2587-2588

8 曾祥吉,李东霞.中药抑菌实验方法的研究[J].现代中西医结合杂志, 2011,20(4):518-520

9 刘彬,卢军.黄芩苷对单核细胞增生李斯特氏菌的体外抑菌作用研究[J].安徽医药, 2016,20(2):244-245

2016-05-18

河北省自然科学基金资助项目(No.H2014406036)，河北省教育厅重点研究项目(No.ZH2012050)，河北省高校百名优秀创新人才支持计划(No.BR2-103)。

*通讯作者：刘翠哲，E-mail：liucuizhexy@163.com。

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