环二鸟苷酸调控细菌生物膜形成的研究进展

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(1.南华大学医学院病原生物学研究所，特殊病原体防控湖南省重点实验室；湖南 衡阳 421001；2.湖南省分子靶标新药研究协同创新中心)

·小专论·

环二鸟苷酸调控细菌生物膜形成的研究进展

胡继宏1,2，朱翠明1,2*

(1.南华大学医学院病原生物学研究所，特殊病原体防控湖南省重点实验室；湖南 衡阳 421001；2.湖南省分子靶标新药研究协同创新中心)

生物膜(BF)是细菌附着到接触物表面形成的多细胞群体，生物膜的形成不仅有利于细菌的生存，同时也增强了感染性。环二鸟苷酸(C-di-GMP)是群体感应系统中的一种重要的胞内信号分子。包含GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(DGCs)可将两分子的GTP合成C-di-GMP，并在含有EAL和HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(PDEs)作用下水解。C-di-GMP的水平在这两种酶调节下发生改变，通过影响下游受体调控细菌的毒性、运动性、纤维素合成、黏附性、生物膜形成等多种功能。本文就细菌生物膜形成和C-di-GMP的调节作用的研究进展做一综述。

生物膜； 环二鸟苷酸； 细菌感染

细菌可以通过聚集或黏附到胞外多糖基质上形成生物膜在宿主中生存，生物膜细胞通常与游离细菌有不同的表型和生理特征。由于吞噬酶类、抗生素及抗体无法进入生物膜内部，因此生物膜的形成显著增强了细菌对这些抗生素的抵抗能力,有利于其在宿主内生存而加剧宿主的损伤和慢性炎症；同时生物膜释放的游离菌又增加了细菌的感染性。生物膜的形成受多种因素的调节，其中C-di-GMP作为细菌中普遍存在的一种重要的信号分子，通过含量的变化参与了生物膜形成的调节过程。

1 细菌生物膜的形成和作用

生物膜(Biofilm，BF)的形成过程包括五个动态的阶段：可逆的黏附、不可逆黏附、生物膜形成、成熟和消散。生物膜的形成开始于游离菌附着生长到生物或非生物表面形成的可逆性的黏附；之后细菌菌落分泌胞外多糖形成不可逆的黏附；接着菌落扩大聚集，结构更加复杂；逐渐成熟为三维的立体结构；最终生物膜结构中又释放出游离菌到其它表面固着[1-2]。

生物膜是细菌包含在胞外多糖、蛋白质和DNA网络中的复杂的三维群体，在宿主组织或植入物当中形成的生物膜与细菌的感染和抗生素抗性的增强有密切的关系[3]。Moskousitz等[4]以囊性纤维化病人中分离的铜绿假单胞菌为材料，发现生物膜形成后对β内酯酰胺类抗生素的抗性较游离细菌明显增高。生物膜的形成增加了对抗生素的抗性，其中一个重要原因是生物膜的生长、蛋白质合成和新陈代谢活动是分层的，膜表面的细菌活动迅速，而中心的细菌生长缓慢甚至停止生长。相对于这一特性有些抗菌肽可通过穿透生物膜来起到抑制其内部细菌存活的作用[5]。

2 C-di-GMP的作用

2.1 C-di-GMP的合成和分解调控环二鸟苷酸(cyclic-di-GMP,C-di-GMP)在鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase，DGCs)参与下由两分子的GTP合成，同时又在磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)的作用下水解。遗传和生化研究表明，GGDEF结构域是DGCs的催化活性部位，EAL和HD-GYP结构域是PDEs的活性部位[6]。全基因组测序表明，包含GGDEF和EAL结构域的蛋白作为一种信号蛋白在细菌中普遍大量存在。Bharati等[7]人在分枝杆菌中发现，同时具有GGDEF和EAL活性的DcpA蛋白能够调节胞内C-di-GMP的水平。

2.2 C-di-GMP的受体C-di-GMP与细胞表面的受体结合后，通过受体信号的转导参与调控了细菌内的多种功能和进程，包括转录[8]、翻译[9]、蛋白质活性[9]、蛋白质分泌和蛋白质稳定性[6]。最终通过影响胞外蛋白、胞外多糖的分泌来改变细菌的表型，从而调控生物膜的形成。C-di-GMP的一些不同特异性受体的分子结构和功能已经得到了充分的研究，这些受体包括PilZ结构域蛋白、退化的GGDEF和EAL结构域蛋白、转录因子等。

2.2.1 PilZ结构域蛋白 PilZ结构域蛋白是Amikam和Galperin在2006年用生物信息学方法发现的第一个胞内C-di-GMP受体，在生物发生上与GGDEF和EAL相近[10]。PilZ的功能包括调节生物毒性、细胞运动型和胞外多糖(如纤维素，藻酸盐)的分泌等[11]。C-di-GMP如何结合不同的PilZ结构域蛋白并影响下游信号尚不清楚，但C-di-GMP与PilZ之间存在着很强的亲和性，这与胞内C-di-GMP的含量低相吻合。

2.2.2 退化的GGDEF和EAL结构域蛋白 C-di-GMP与一些失去活性的退化的GGDEF和EAL结构域蛋白结合，改变了这些蛋白亚基间的交联。如铜绿假单胞菌中的PelD蛋白[12]，以及霍乱弧菌中的CdgG蛋白[13]，都能与C-di-GMP结合，但对其功能和结构均无作用，所以这一分子特性可用于研制C-di-GMP的特异性抑制剂。荧光假单胞菌中包含退化的EAL结构域的LapD蛋白可以通过与C-di-GMP的结合，将C-di-GMP的胞内水平传递到胞外来控制生物膜的合成[14]。

2.2.3 转录因子 C-di-GMP还可与一些转录因子结合，调控基因的表达。例如铜绿假单胞菌中的FleQ蛋白作为C-di-GMP的受体，通过控制转录过程可以调节鞭毛基因的表达。与C-di-GMP结合后的FleQ蛋白失去与pel启动子的联系，导致pel操纵子启动表达，而pel参与了胞外多糖的分泌[15]。

3 C-di-GMP与生物膜的形成

C-di-GMP作为一种细菌普遍存在的第二信使分子，通过DGCs，PDEs两种酶对其量的调节，影响下游信号，从而调控细菌的多种生理活动。如在铜绿假单胞菌当中外界信号被跨膜受体蛋白接受传导，转录调控因子AlgR与DGC mucR的基因启动子结合增加了mucR的表达，从而提高胞内C-di-GMP的水平。

3.1 C-di-GMP促进胞外多糖的形成C-di-GMP可以调节胞外多糖的产生、细菌的定植和生物膜的形成等过程。胞外多糖分泌的增加和细菌的定植是生物膜形成的先决条件。在铜绿假单胞菌中，胞内高水平的C-di-GMP与PelD和Alg44蛋白的结合过程促进了多糖和藻酸盐的合成，目前研究较为清楚的是合成酶依赖的合成途径，在这种途径中，多糖链的聚合是通过多亚基酶的催化来完成的。纤维素是细菌生物膜的重要组成部分，纤维素合成复合物中的糖基转移酶可以通过与C-di-GMP结合被激活，促进了聚合物的延长，进而合成纤维素单链分子。胞内C-di-GMP量的增加最终导致胞外多糖的增多，从而促进了生物膜的形成和聚集。

3.2不同来源C-di-GMP对生物膜影响不同高水平的内源性C-di-GMP促进了细菌的运动，加强了鞭毛的形成和细菌的消散。Nakhamchik等[16]用质粒过表达C-di-GMP的方法在创伤弧菌中发现了这样的调节过程。此外，外源性的C-di-GMP能抑制细菌生物膜的形成，Yan等[17]发现，在变形链球菌中，外源性的C-di-GMP有明显的抑制细菌黏附的作用，并且一定浓度的外源C-di-GMP能显著降低生物膜的形成，而且抑制呈剂量依赖性关系。总的来说，胞内C-di-GMP的增多能够增强细菌生物膜的形成能力，而一定量的外源C-di-GMP却能够抑制细菌生物膜的形成。

4 结 语

自然界中绝大多数的细菌均能以生物膜的形式生存，它是细菌为了适应环境所形成的细胞聚集状态。生物膜形成后的抗药，引起慢性炎症等特性为感染性疾病的治疗带来了巨大的困难，同时造成的反复感染也增加了病人的痛苦。近年来，对C-di-GMP的调节功能的研究不断发展，对其参与的信号调节通路的研究也将更加完善。同时，C-di-GMP作为生物膜形成的调节分子，为生物膜研究提供了新的靶标，并为抗生物膜感染研究提供了方向。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.026

2017-01-04；

2017-04-14

湖南省分子靶标新药研究协同创新中心资助项目(湘教通[2015]351号).

*通讯作者，E-mail：nhzhucuiming@126.com.

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