非对称二甲基精氨酸与线粒体功能的研究进展

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(中南大学湘雅药学院药理学系，湖南 长沙 410078)

·讲座与综述·

非对称二甲基精氨酸与线粒体功能的研究进展

陈慧丽，李元建，江俊麟*

(中南大学湘雅药学院药理学系，湖南 长沙 410078)

线粒体功能障碍参与多种心血管疾病的发生与发展，其突出表现为线粒体生物合成减少和线粒体动力学改变，主要由一氧化氮(NO)减少及氧自由基增加所致。最新研究发现，内源性一氧化氮合酶抑制物(NOS)非对称二甲基精氨酸(ADMA)，是导致NO水平下降和氧自由基水平升高的重要机制，也是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等心血管疾病中线粒体功能障碍的重要原因。本文对ADMA与线粒体功能障碍之间的关系及可能的机制进行简要综述。

非对称二甲基精氨酸； 线粒体功能障碍； 一氧化氮； 氧化应激

线粒体是真核细胞内一种具有双层膜结构的细胞器，由外膜、膜间隙、内膜和基质组成。线粒体不仅是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的主要场所，而且还参与细胞中许多重要生命活动(如维持细胞内离子稳态、生成活性氧及调节细胞凋亡)。近年来，越来越多的研究发现线粒体功能障碍是促进动脉粥样硬化、高血压、糖尿病及糖尿病血管病变等多种心血管疾病发生发展的重要因素。多种心血管疾病的高危因素(如高脂、高糖、低氧)通过影响线粒体膜通透性，增加活性氧生成，导致线粒体膜电位下降和线粒体基质肿胀，进而引起线粒体功能障碍和细胞裂解凋亡[1]。因此，调节线粒体功能可能是治疗心血管疾病的重要药物靶点。

线粒体功能障碍表现为线粒体生物合成障碍[2]和线粒体动力学改变[3]，主要由一氧化氮(nitric oxide,NO)减少[4]，氧自由基产生增加[5]所致。非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一种新的心血管疾病预测因子，不仅能竞争性抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)，减少NO产生，而且还可促进活性氧的生成。因此，ADMA可能对线粒体功能具有重要的调节作用。本文就近年ADMA对线粒体功能影响的研究进展综述如下。

1 ADMA的生物学特征

真核生物有三种甲基化精氨酸：单甲基精氨酸(NG-monomethyl-L-arginine,L-NMMA)、ADMA和对称二甲基精氨酸(symmetric dimethylarginine,SDMA)。它们都是由细胞内一些含精氨酸残基的蛋白质经蛋白精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferase,PRMT)甲基化修饰形成。目前在哺乳动物中已发现两种PRMT亚型：PRMTⅠ和PRMTⅡ，前者主要促进ADMA与L-NMMA的形成，而后者主要生成SDMA与L-NMMA。ADMA和L-NMMA是NOS抑制物，通过与左旋精氨酸竞争NOS活性结合位点，抑制NO生成。由于血浆中ADMA的浓度约为L-NMMA的10倍，因此，ADMA被认为是机体内主要的NOS抑制物。ADMA有三种代谢途径：二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase,DDAH)水解、丙氨酸乙醛酸氨基转移酶(alanine-glyoxylate aminotransferase-2,AGXT2)代谢和肾脏排泄。约80%的ADMA被DDAH特异性地水解生成瓜氨酸和二甲胺，余下部分通过AGXT2水解和肾脏清除。DDAH有两种亚型：DDAH1和DDAH2，分别由不同基因编码。DDAH1主要分布于表达神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)的组织如大脑、肾脏；DDAH2主要分布于表达内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的组织中如血管、心脏、脾[6]。

2 ADMA对线粒体功能的影响

2.1减少线粒体生物合成线粒体生物合成是指形成新的线粒体及生成ATP的能力。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator,PGC-1α)是调控线粒体生物合成的核心因子，NO可通过可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)信号途径增加PGC-1α表达，促进线粒体生物合成。越来越多的研究认为线粒体生物合成减少可能是动脉粥样硬化、糖尿病等心血管疾病线粒体功能障碍的重要因素。在高脂血症、糖尿病、胰岛素抵抗等患者和动物，心脏[7]、骨骼肌[8]、肝脏[9]和脂肪细胞[10]中线粒体密度、ATP合成和PGC-1α表达明显减少。研究表明[11]，给予8周龄雄性野生型小鼠3个月或12个月的卡路里限制后，心脏、骨骼肌、肝脏、白色脂肪组织、棕色脂肪组织、脑中eNOS表达和环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)形成增加，并伴随线粒体合成和ATP产生增加，而eNOS基因敲除小鼠则可明显抑制卡路里限制诱导的cGMP、PGC-1α和线粒体合成增加。在持续性肺动脉高压胎羊模型中[12]，肺动脉内皮细胞和肺组织线粒体DNA复制数、ATP水平、电子转运链复合物亚基和PGC-1α水平均明显减少，而给予NO供体DetaNONOate后，线粒体DNA复制数和ATP水平明显增加。上述研究表明NO是参与线粒体生物合成的重要因子。ADMA作为NOS的内源性抑制物，不仅可减少NO生成，而且在高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等心血管疾病的发生发展中起重要作用。新近研究发现：在链脲佐菌素诱导的1型[13]和2型[14]糖尿病大鼠，血浆ADMA含量明显增加，而反映心肌线粒体DNA含量的细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(COXⅠ)/β-actin比值与线粒体合成的关键调节因子PGC-1α转录明显减少；在老年大鼠[15]，血浆内源性ADMA水平升高的同时也伴有心肌线粒体生物合成减少，且两者呈明显负相关；在培养的大鼠心肌细胞H9C2[14]，外源性ADMA可直接抑制心肌细胞线粒体生物合成与ATP生成。这些结果提示，ADMA是导致心肌组织线粒体生物合成障碍的重要效应分子。另外，研究亦发现ADMA不仅可抑制心肌细胞线粒体生物合成，也可抑制肝细胞、支气管上皮细胞线粒体生物合成。Chen等[16]不仅在糖尿病大鼠发现血浆ADMA升高与肝脏线粒体生物合成抑制(COXⅠ与β-actin拷贝数比值降低和PGC-1α表达下调)及ATP生成减少密切相关，而且在培养的大鼠肝细胞H4IIE证明外源性ADMA可直接减少线粒体DNA含量、ATP生成和PGC-1α表达。WU等[17]也发现NOS抑制剂L-N-硝基精氨酸甲酯(L-N(G)-Nitroarginine Methylester,L-NAME)可加重花生四烯酸诱导的大鼠肝细胞线粒体生物合成减少，而NO供体S-亚硝基乙酰青霉胺则可减轻花生四烯酸所致大鼠肝细胞线粒体生物合成的降低。在支气管上皮细胞[18]，ADMA可加重氧化应激和硝化应激，诱导细胞低氧反应，减少PGC-1α表达和线粒体合成。此外，硝化应激亦可直接导致线粒体损伤，减少线粒体合成。综上所述，ADMA可能通过下调PGC-1α表达，抑制线粒体生物合成，诱导线粒体功能障碍。

2.2降低线粒体膜电位线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)是反映线粒体内膜通透性的最佳指标之一。MMP的形成与保持不仅可以调控线粒体内膜对各种物质的选择性和通透性，而且是呼吸链氧化磷酸化中的必要过程，在维持线粒体正常结构与功能中起重要作用。线粒体膜电位下降是细胞凋亡的早期表现，一旦线粒体膜电位下降，将导致呼吸链的氧化磷酸化链失偶联、线粒体基质膨胀和破裂、促凋亡蛋白释放，细胞进入不可逆的凋亡过程，而抑制线粒体膜电位下降，就可阻抑细胞凋亡的发生[19]。大量研究发现多种心血管的高危因素如高糖、高脂均可诱导细胞线粒体膜电位下降，导致细胞死亡。潘瑶等[13]在培养的心肌细胞或肝脏细胞[16]证明内、外源性NOS抑制物ADMA或L-硝基精氨酸均可直接导致细胞线粒体膜电位下降，引起线粒体功能受损。有趣的是，ADMA在神经细胞对线粒体膜电位有不同报道。在PC12细胞[20]，1-甲基4-苯基吡啶离子(1-methyl,4-phenyl pyridium,MPP+)可特异性抑制线粒体呼吸链中复合物酶I的活性，引起氧化磷酸化崩解、Ca2+超载，从而激活nNOS，导致NO大量生成。过多的NO与线粒体产生的过氧化物作用生成过硝酸酸盐，从而引起线粒体蛋白和DNA的氧化，导致线粒体膜电位下降、呼吸链电子传递障碍和ATP 合成不足，而ADMA可减轻MPP+诱导的PC12细胞线粒体膜电位的下降、细胞色素C的增加。这种作用的差异尚不清楚：可能由于细胞类型不同，对ADMA的作用有差别；也可能是导致细胞损伤的危险因素不同，NO生成不同。在心肌细胞、肝细胞、支气管上皮细胞是高糖等外源性因素导致NO减少，ADMA增多，而在神经细胞是MPP+导致NO过度生成，ADMA通过抑制NOS过度激活、NO过度生成，降低细胞内ROS水平而减轻MPP+所致的神经细胞线粒体功能障碍。

3 ADMA影响线粒体功能的机制

3.1增加氧化应激线粒体不仅是活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生的主要部位，而且是ROS攻击的首要靶点。在线粒体电子链传递过程中，一部分电子在传递至细胞色素C氧化酶之前漏出呼吸链，与氧发生单电子还原反应生成超氧阴离子、过氧化氢或羟自由基，导致氧化应激。后者可抑制线粒体呼吸酶活性，减慢呼吸链电子传递，使线粒体内膜通透性转换孔持续开放、质子跨膜梯度下降、线粒体膜电位降低和ATP生成减少，引起线粒体功能受损。近年来有文献报道，ADMA可促进氧化应激的发生。在高脂血症、动脉粥样硬化、1型和2型糖尿病患者和大鼠血管[21]、心脏[14]、肝脏[16]氧化应激增加与血浆ADMA升高密切相关；在培养的内皮细胞[22]、肝细胞株H4IIE[16]等，ADMA可通过抑制NOS使其与L-精氨酸之间的电子传递解偶联，明显增加细胞活性氧生成，诱导氧化应激，进而导致线粒体功能障碍。在肺动脉内皮细胞[22]，ADMA可促进eNOS解偶联，使eNOS从胞浆膜转位至线粒体，增加线粒体蛋白硝化水平，导致线粒体合成障碍，而ATP减少可降低热休克蛋白90(90-kDa heat shock protein,HSP90)的活性，阻止HSP90-eNOS相互作用，进一步加重eNOS解偶联、加重线粒体功能障碍，形成恶性循环。进一步研究发现[23]，ADMA通过促进肺动脉内皮细胞Akt1酪氨酸残基Y350位点硝化反应，使eNOS的S617和S1179位点磷酸化，进而诱导eNOS线粒体转位。ADMA亦可通过增强Akt1在Thr308和Ser473位点磷酸化，减弱HSP90-Akt1相互作用，增加HSP70水平，减弱Akt1与其抑制剂C端调节蛋白之间的相互作用，促进eNOS磷酸化并转位至线粒体。这种转位可引起肉毒碱乙酰转移酶(carnitineacetyl transferase,CrAT)硝化增加和CrAT活性降低，导致酰基肉毒碱水平升高诱导线粒体功能障碍，而L-精氨酸可逆转这些病理变化[24]。另外，研究亦发现ADMA可通过促进三磷酸鸟苷环化水解酶降解，使NOS辅因子四氢生物嘌呤减少，最终导致eNOS失偶联，线粒体超氧阴离子增加，进一步加重线粒体功能障碍[25]。同时，ROS本身也可导致ADMA生成增多，进一步诱导线粒体产生更多的ROS[26]。综上所述，诱导氧化应激可能是ADMA导致线粒体功能障碍的重要机制。

3.2上调解偶联蛋白2表达解偶联蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)是定位于线粒体内膜上的一种离子通道，通过介导质子跨膜内流，驱散线粒体内膜两侧的质子浓度梯度，降低线粒体膜电位，使底物氧化和ADP磷酸化解偶联，进而使ATP生成减少，导致线粒体功能障碍。研究发现，1型[13]、2型[14]糖尿病大鼠和老年大鼠[15]血浆ADMA浓度升高，并伴有心脏和肝脏UCP2水平上调，线粒体膜电位降低以及ATP生成减少。相关性分析结果显示，ADMA浓度与UCP2水平呈正相关。类似现象在细胞实验也被证实：在大鼠肝细胞H4IIE和心肌细胞，ADMA可直接上调UCP2水平，引起线粒体功能障碍，而NO供体硝普钠则可降低UCP2水平，改善线粒体功能；在脂肪细胞[27]，外源性NOS抑制剂L-NAME可减轻肿瘤坏死因子α对细胞UCP2表达的抑制作用，而用NO供体孵育则产生相反作用。这些结果提示，上调UCP2转录水平可能是ADMA导致线粒体功能障碍的机制之一。

3.3改变线粒体动力学蛋白线粒体动力学包括线粒体的融合与分裂。线粒体融合和分裂之间的平衡控制着线粒体数量和质量，是维持生物体众多生理活动的基础如细胞分裂、细胞凋亡等，同时也在ATP生成、自由基清除等过程中起重要作用。动力学相关蛋白1(dynamic related protein 1,Drp1)和线粒体外膜分裂蛋白1(fission protein 1,Fis1)是线粒体分裂的重要因子。研究表明，2型糖尿病患者臂静脉血管内皮细胞[28]Fis1和Drp1表达明显增加，并伴随线粒体ROS水平升高，线粒体结构片段化，而抑制ROS产生可抑制Drp1表达，阻碍线粒体分裂。ADMA是影响氧化应激的重要因素，也可能通过促进线粒体分裂导致线粒体功能受损。Miller等[29]发现一氧化氮合酶抑制物L-NAME可引起大鼠主动脉线粒体动力学蛋白表达模式的显著改变(线粒体融合蛋白mitofusin 1、mitofusin 2和optic atrophy 1减少，线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1增加)，导致线粒体融合减少、分裂增加。De Palma等[30]发现L-NAME可增加分化型生肌前体细胞Drp1转位至线粒体，并与Fis1相互作用，进而促进线粒体分裂，导致线粒体功能障碍。这些研究提示，改变线粒体动力学蛋白可能是ADMA导致线粒体功能障碍的另一机制。

4 小 结

线粒体功能障碍的机制复杂多样并相互联系、相互影响。随着研究的不断深入，线粒体功能障碍在心血管疾病中的重要地位逐渐凸显。ADMA为NOS内源性抑制物，可通过引起线粒体功能障碍而在心血管疾病的发生发展中起重要作用。因此对ADMA与线粒体功能的研究将有助于为今后心血管疾病的研究和防治开拓新思路。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.001

2017-02-19；

2017-05-01

国家自然科学基金面上项目(81373408).

*通讯作者，E-mail:junlinjiang@csu.edu.cn.

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