噬菌体展示技术及其在病原微生物研究中的应用进展

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(南华大学病原生物学研究所，湖南 衡阳 421001)

·小专论·

噬菌体展示技术及其在病原微生物研究中的应用进展

邓湘赢，曾焱华*

(南华大学病原生物学研究所，湖南 衡阳 421001)

噬菌体是能特异性地感染细菌的一类病毒，其基因数目少，结构相对简单，容易在分子水平上操控其基因。噬菌体展示技术是将外源肽或蛋白以融合蛋白形式表达并呈现在噬菌体衣壳表面的分子生物学技术。与传统的研究方法相比，噬菌体展示技术具有通量高、成本低、操作简单、耗时短等优点。本综述主要聚焦噬菌体展示技术在病原微生物抗原筛选、抗体制备和疫苗研制等方面的应用进展。

噬菌体； 噬菌体展示技术； 病原微生物

噬菌体是能特异性感染细菌的病毒，因其结构简单、基因数目少而成为分子生物学研究的重要模型系统。Smith最早用丝状噬菌体作为载体进行分子生物学研究并首次介绍了噬菌体展示技术[1]。噬菌体具有高度的基因灵活性是噬菌体展示技术的基础。该技术可将外源蛋白的基因型和表型、蛋白质分子结合活性和噬菌体的可扩增性结合在一起。近年来，随着分子生物学技术的不断发展及各学科间的交叉融合，噬菌体展示技术被不断地改进与完善，在蛋白质相互作用、细胞信号转导、疾病诊断与治疗、抗原表位筛选与疫苗研制等领域得到广泛应用。本文主要介绍噬菌体展示技术的概况及其在病原微生物研究中的应用进展。

1 噬菌体展示技术概况

噬菌体展示技术是将外源多肽或蛋白表达并呈现在噬菌体表面的一种分子生物学技术，其原理是将外源DNA片段插入到一个编码噬菌体衣壳蛋白的基因中，与衣壳蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，由于展示的外源多肽或蛋白能保持良好的生物学活性，因而能与目标分子特异结合。同时，外源多肽或蛋白的融合表达并不会影响重组噬菌体感染宿主的能力，通过简单的“生物淘选与扩增”即可获得重组噬菌体。

目前，已经发现超过5 500种噬菌体，根据噬菌体的生活周期不同，可以将其分为烈性噬菌体和温和噬菌体。常用的烈性噬菌体主要包括λ噬菌体、T7噬菌体和T4噬菌体等，温和噬菌体主要包括M13和fd等。两种类型的噬菌体作为载体时在以下几方面各有优劣：①纯化步骤：M13噬菌体在增殖期间不裂解宿主菌，噬菌体易于纯化；而T7,T4和λ噬菌体等裂解性噬菌体，纯化比较繁琐。②生长速度：T7噬菌体比M13生长快，在几个小时内就能形成噬菌斑。③稳定性：重组的T7噬菌体比M13更稳定，适应环境的能力更强。④插入片段大小：M13噬菌体允许插入的片段较短，而T7噬菌体可允许插入大于1 kb的外源基因。因此，研究人员应根据展示蛋白的性质和研究目的合理地选择噬菌体载体。

2 噬菌体展示技术在病原微生物研究中的应用

2.1受体筛选多数病原微生物表面表达的某些特异的膜蛋白能与宿主细胞表面的受体结合，然而这些受体分子表达量很少，通常难以检测到，更无法纯化。利用噬菌体展示技术能高效筛选到这些膜蛋白的受体。目前有3种筛选方法：①用纯化的病原微生物表面配体蛋白作为靶分子进行淘选；②用完整的病原微生物进行淘选；③将噬菌体肽库注射到模型动物体内，噬菌体表面展示的潜在外源配体多肽或蛋白与特定组织结合，再解剖特定组织进行淘选。

如Basha等[2]以炭疽毒素主要受体为靶分子，从M13噬菌体展示肽库中筛选到一段能与该受体特异结合的多肽，该多肽能有效地阻断ANTXR1(Anthrax toxin receptor 1)和ANTXR2(Anthrax toxin receptor 2)与炭疽毒素的结合。乙肝病毒包膜蛋白上的preS1抗原对乙肝病毒黏附、感染肝细胞至关重要[3]。Ye等[4]通过淘选噬菌体多肽库，得到了与preS1特异性结合的短肽B10，并证实该多肽能有效的阻止乙肝病毒黏附到肝细胞上。综上所述，利用噬菌体展示技术可以筛选到病原微生物上的配体或者与配体相结合的、宿主细胞表面的受体，这对于病原微生物致病机制的研究至关重要，同时也为利用其模拟分子或拮抗分子阻挡病原微生物对宿主细胞的感染和疫苗研究奠定了理论基础。

2.2抗原表位分析及抗原筛选噬菌体展示技术是低成本高效分析病原微生物抗原表位的研究方法，抗原表位的研究能为阐明病原微生物的致病机制、感染性疾病的诊断、免疫治疗和疫苗研制奠定基础。本课题组Zeng等[5]以纯化的生殖支原体黏附蛋白(MgPa)的多克隆抗体为靶分子，从噬菌体展示随机十二肽库中筛选到MgPa的模拟表位。Cariccio等[6]用噬菌体展示技术筛选到了脑膜炎奈瑟氏菌表面粘附素A抗体的模拟表位。目前，噬菌体展示随机肽库是用于筛选病原体模拟表位的有力工具。

利用噬菌体展示cDNA文库也能筛选到某些特异性抗原。Talwar等构建基于支气管肺泡灌洗细胞和白细胞的T7噬菌体展示cDNA混合文库，筛选该文库获得了1 152个肉状瘤病的潜在抗原[7]。Kim等[8]证实利用噬菌体cDNA文库筛选到的异质性核糖核蛋白H3(Hnrph3)为葡萄膜炎眼部的抗原之一。Guo等[9]利用噬菌展示技术筛选到类鼻疽伯克氏菌的保护性抗原。总之，噬菌体展示技术，尤其是噬菌体cDNA文库为抗原筛选提供了便利。

2.3抗体制备单克隆抗体在医学诊断与治疗领域被认为具有划时代意义，大部分单克隆抗体都可以从实验室动物获得，但是费时费力且产量低。通过噬菌体抗体库技术可以快速高效的筛选到高特异性的单克隆抗体基因型，在原核系统中大规模表达后即可获得相应的单克隆抗体。利用噬菌体展示技术获取特异性抗体的主要优势在于速度快、不需要免疫动物，成功避开了体内生产抗体的繁琐步骤。Mohammadzadeh等[10]成功地构建了噬菌体抗体库，从中筛选到了可以特异性中和HIV-1 p24的抗体。Chen等[11]从噬菌体抗体库中筛选到4种能中和肠道病毒71型的抗体。Qiao等[12]用HIV-1糖蛋白gp120淘选噬菌体肽库，获得了一种新的人类单克隆抗体A16。

2.4早期诊断病原微生物表面的某些特异分子或抗原可用于微生物的特异诊断。在抗原未知或者不容易获得的情况下，使用噬菌体展示肽库技术可获得相应的抗原表位，从而进一步找到可能的特异性诊断标志物，用于研发临床诊断试剂。本课题组Wang等[13]以纯化的结核病人血清为靶分子，从噬菌体展示随机十二肽库中筛选到能与结核病阳性血清特异结合的两条多肽，基于这两条多肽建立的结核病血清学诊断试验具有较高的敏感性与特异性。Wu等[14]从噬菌体抗体文库中筛选到能与流感病毒特异结合的单链可变区抗体，可用于流感病毒诊断试剂的研发。Jang等[15]从噬菌体文库中筛选到能与肺炎链球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)特异结合的多肽2B11，可用于肺炎链球菌感染的诊断。综上所述，通过噬菌体展示肽库获得的抗体，具有很高的特异性和灵敏度，在临床诊断上具有很好的应用前景。

2.5疫苗研制噬菌体作为疫苗载体，可以分为噬菌体DNA疫苗和噬菌体展示疫苗。与标准的DNA疫苗相比，噬菌体DNA疫苗由于有噬菌体衣壳蛋白的保护，能有效阻止DNA降解，从而能诱导更强、更持久的免疫应答。噬菌体展示疫苗能将外源性抗原展示到噬菌体表面，随着噬菌体的增殖，外源性抗原的表达水平也不断增加，使机体产生较高的免疫应答。

如本课题组Zeng等[16]将从噬菌体展示肽库中筛选到的MgPa的模拟表位制备成多抗原肽，该多抗原肽能诱导小鼠产生较强的体液免疫与细胞免疫应答。Bahadir等[17]将HBcAg的全蛋白展示在M13噬菌体表面，证实该重组噬菌体在BALB/c小鼠体内有较好的免疫原性。Khurana等[18]利用噬菌体肽库技术研制埃博拉病毒的疫苗。Li等[19]利用噬菌体展示技术淘选到针对于流感病毒血凝素亚单位2(HA2)的单链可变片段，可用于流感疫苗的研制。因此，噬菌体疫苗在病原微生物疫苗研究中显示出巨大的潜力。

3 总结和展望

噬菌体展示技术以其高库容、高效方便及灵活筛选等优势在生命科学许多领域得到广泛应用，尤其在病原微生物的诊断和治疗领域正越来越受到重视。然而，噬菌体展示技术的应用也存在以下一些限制：①在载体的选择方面，虽然噬菌体的种类有上千种，但最常用的载体只有属于温和噬菌体的M13，fd以及属于烈性噬菌体的T7和T4等，这表明在噬菌体载体研究上还有很广阔的空间。②噬菌体的增殖和相应外源肽或蛋白的表达要依靠宿主基因，因此，毒性的分子肽或蛋白不利于进行表达和展示，这为应用噬菌体展示技术研究毒性多肽或蛋白质带来不便。③编码多肽或蛋白质基因的偏爱性，可能导致噬菌体肽库的多样性受到限制。④携带有抗原模拟表位的噬菌体进入机体后，一方面诱导机体产生针对模拟表位的抗体，另一方面也诱导机体产生针对噬菌体和其它蛋白的抗体。⑤通过噬菌体抗体库筛选到的病原微生物的特异抗体在产量、稳定性等方面还达不到临床要求，仍需做大量深入的研究工作。噬菌体展示技术虽然存在以上缺陷，但随着噬菌体展示技术和噬菌体肽库技术的不断完善与发展，该技术势必会给病原微生物的诊断、治疗与疫苗研制等带来更广阔的应用前景。

[1] Smith GP.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface [J].Science,1985,228(4705):1315-1317.

[2] Basha S,Rai P,Poon V,et al.Polyvalent inhibitors of anthrax toxin that target host receptors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(36):13509-13513.

[3] Wang W,Liu Y,Zu X,et al.Blocking peptides against HBV:preS1 protein selected from a phage display library [J].BiochemBiophys Res Commun,2011,412(4):633-637.

[4] Ye X,Zhou M,He Y,et al.Efficient inhibition of hepatitis B virus infection by a preS1-binding peptide [J].Sci Rep,2016,6:29391.

[5] Zeng Y,Liu L,He J,et al.Screening and identification of the mimic epitope of the adhesion protein of Mycoplasma genitalium[J].Can J Microbiol,2012,58(7):898-908.

[6] Cariccio VL,Domina M,Benfatto S,et al.Phage display revisited:Epitope mapping of a monoclonal antibody directed against Neisseria meningitidisadhesin A using the PROFILER technology[J].MAbs,2016,8(4):741-750.

[7] Talwar H,Rosati R,Li J,et al.Development of a T7 phage display library to detect sarcoidosis and tuberculosis by a panel of novel antigens[J].E Bio Medicine,2015,2(4):341-350.

[8] Kim Y,Caberoy NB,Alvarado G,et al.Identification of Hnrph3 as an autoantigen for acute anterior uveitis[J].ClinImmunol,2011,138(1):60-66.

[9] Guo P,Zhang J,Tsai S,et al.Developing peptide mimotopes of capsular polysaccharides and lipopolysaccharides protective antigens of pathogenic burkholderia bacteria[J].Monoclon Antib Immunodiagn Immunother,2016,35(3):125-134.

[10] Mohammadzadeh S,Rajabibazl M,Fourozandeh M,et al.Production of recombinant scFv against p24 of human immunodeficiency virus type 1 by phage display technology [J].Monoclon Antib Immunodiagn Immunother,2014,33(1):28-33.

[11] Chen Z,Ren X,Yang J,et al.An elaborate landscape of the human antibody repertoire against enterovirus 71 infection is revealed by phage display screening and deep sequencing [J].MAbs,2017,9(2):342-349.

[12] Qiao Y,Man L,Qiu Z,et al.Isolation and characterization of a novel neutralizing antibody targeting the CD4-binding site of HIV-1 gp120[J].Antiviral Res,2016,132:252-261.

[13] Wang L,Deng X,Liu H,et al.The mimic epitopes of Mycobacterium tuberculosis screened by phage display peptide library have serodiagnostic potential for tuberculosis [J].Pathog Dis,2016,74(8).

[14] Wu J,Zeng XQ,Zhang HB,et al.Novel phage display-derived H5N1-specific scFvs with potential use in rapid avian flu diagnosis[J].J Microbiol Biotechnol,2014,24(5):704-713.

[15] Jang S,Kim G,Oh J,et al.Molecular characterization of a single-chain antibody variable fragment (scFv) specific for PspA from Streptococcus pneumoniae [J].Biochem Biophys Res Commun,2017,482(1):141-146.

[16] Zeng Y,You X,Liu L,et al.The immune effects of multiple antigen peptides containing the mimic epitopes of the adhesion protein of Mycoplasma genitalium [J].Can J Microbiol,2013,59(7):479-484.

[17] Bahadir AO,Balcioglu BK,Uzyol KS,et al.Phage displayed HBV core antigen with immunogenic activity[J].Appl Biochem Biotechnol,2011,165(7-8):1437-1447.

[18] Khurana S,Fuentes S,Coyle EM,et al.Human antibody repertoire after VSV-Ebola vaccination identifies novel targets and virus-neutralizing IgM antibodies[J].Nat Med,2016,22(12):1439-1447.

[19] Li TW,Cheng SF,Tseng YT,et al.Development of single-chain variable fragments (scFv) against influenza virus targeting hemagglutinin subunit 2 (HA2)[J].Arch Virol,2016,161(1):19-31.

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.025

2017-01-04；

2016-03-24

国家自然科学基金(NO:31370207)资助.

*通讯作者，曾焱华，E-mail:zengyihua21cn@126.com.

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