SSR分子标记鉴定青花菜杂交种‘津青一号’的纯度

江汉民++文正华++刘莉莉++单晓政++孙德岭

摘 要：以青花菜新品种‘津青一号及其亲本为试验材料，用SSR分子标记技术鉴定杂交种种子纯度，从50对SSR引物中，筛选出了1对在杂交种和父、母本之间存在显著差异的引物（L21），该引物扩增片段电泳条带清晰可辨，且杂交种含有父、母本的特异互补带型。利用该引物对108株‘津青一号杂交种进行纯度鉴定，结果为96.30%，与大田形态鉴定结果98.15%相比，SSR标记与大田种植鉴定结果基本一致。这表明，引物L21可用于‘津青一号的纯度鉴定。

关键词：青花菜；SSR；种子纯度鉴定

中图分类号：S635.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.

Hybrid Purity Identification of Broccoli Variety ‘Jinqing No.1 Using SSR Method

JIANG Hanmin， WEN Zhenghua， LIU Lili， SHAN Xiaozheng， SUN Deling

（Key Laboratory of Vegetable Germplasm Resources Innovation，Tianjin Kernel Vegetable Research Institute，Tianjin 300384，China）

Abstract： In this paper， broccoli hybrids， 'Jinqing No.1' and its parents were used as plant materials，SSR molecular marker was used to analysis the polymorphism of these materials. Among the 50 pairs of SSR primers screened，one pair of primers（L21） had significant and legible differences between hybrid seeds and their parents. 108 individual seeds were tested with the primer， and the seed purity was 96.30%， which was closed to the result identified in the field of 98.15%.The results indicated SSR primer L21 could be used to detect the purity of 'Jinqing No.1'.

Key words： Broccoli； SSR； seed purity identification

青花菜（Brassica oleracea L.var.italica），又名西兰花、青花椰菜等，属于十字花科芸薹属1、2年生草本植物。青花菜以主茎及侧枝顶端形成的绿色花球为食用部位，营养物质丰富，无论色泽、口感都备受青睐，深受广大群众所喜爱。

在青花菜的种植生产中，青花菜杂交种子的纯度在很大程度上影响了品质和产量。在种子生产中，由于一些不可避免的因素混入自交产生的F1代种子或劣质种子及一些其他品种的杂交后代，从而导致生产出的种子纯度不高。在种子市场上，不法商贩销售的假冒种子在很大程度上也降低了种子的质量。保证杂交种子的纯度及优良品质，成为确保青花菜市场供应优质青花菜的一个重要前提。鉴定种子纯度的传统方法是大田形态学鉴定，该方法在鉴定周期和鉴定费用上有其局限性，且形态观察的准确度难以保证。分子标记技术的出现使种子在分子水平上的鉴定成为可能。分子标记技术在种子鉴定方面的应用，节省了鉴定的时间和成本。SSR是DNA分子标记中的一种，是以PCR为基础的技术，多态性高，成本较低，标记呈显性和共显性，操作较易实现，重复性较好[1]。有研究报道，利用SSR分子标记技术能准确鉴定青花菜种子的纯合度[2]。此外，SSR分子标记也已经应用到其他经济作物种子纯度的鉴定，包括水稻、油菜、大豆、玉米等[3-10]。

本研究以津青一号及其父、母本为研究材料，利用SSR分子标记进行筛选，以期得到能产生特殊标记的引物，在检验该引物可靠后将其运用到杂交种子的鉴定中，供杂交种子在分子水平鉴定借鉴。

1 材料和方法

1.1 材 料

试验材料为11DR-100（父本）、10FS-2（母本）、津青一号（F1代）。

1.2 SSR鉴定种子纯度的评价

1.2.1 全基因组DNA提取 以改良CTAB法提取全基因组DNA，获得的全基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度并保存备用。

1.2.2 SSR引物 根据GenBank（http： / /www.ncbi.nlm.nih.gov /sites /entrez）网站上公布的青花菜EST序列设计合成SSR引物，选取长度大于100 bp的EST序列，共合成SSR引物50对。

1.2.3 标记筛选 以11DR-100、10FS-2及津青一号的全基因组DNA为模板，对50对SSR引物进行筛选，筛选出可在杂交F1代中扩增出与父母本互补带型的引物。扩增程序为：94 ℃，5 min； 94 ℃，1 min；55 ℃，1 min；72 ℃，45 s；20 cycles；72 ℃，10 min。扩增产物用3%的琼脂糖凝胶电泳进行筛选。

1.2.4 分子标记筛选的评价 在种有津青一号的试验田内进行随机抽样，随机选取12个区域，每个区域随机选取9株，通过大田形态学方法对抽取的植株进行纯度鉴定，并用已筛选到的SSR分子标记进行检测，检测得到的结果与试验田种植结果进行比较，以评价所筛选出的分子标记的可用性。种子纯度=（1-非杂交F1个体总数/鉴定的个体总数）×100%[11]。

1.3 种子纯度的鉴定

随机选取种子300粒进行鉴定。以种子长出的真叶为材料进行DNA提取，具体方法为：将滤纸浸湿后放入培养皿中，将种子放于滤纸上，于28 ℃培养箱中培养，培养过程中注意保湿，待长出真叶后用于全基因组DNA提取，方法同1.2.1。

2 结果与分析

2.1 全基因组DNA提取结果

11DR-100、10FS-2、‘津青一号的全基因组DNA提取结果如图1。结果显示，DNA主条带较单一，没有明显的降解现象，表明本试验用的改良CTAB提取法能获得高质量的全基因组DNA，获取的DNA可用于后续的SSR分子标记的筛选。

2.2 标记筛选结果

50对SSR引物扩增11DR-100、10FS-2、津青一号，对双亲及F1代进行特异分子标记分析，筛选可用的SSR标记。经PCR扩增后，有43对引物可扩增出有效条带，并从中筛选出1对可用于鉴定的引物L21（F：5′-GGATTTTCAAGACTCTTCGGG-3′，R：5′-TGCCAAGTTCGTAGTCTTGC-3′）。该引物可在亲本中扩增出单一互补的条带，在双亲和F1代中共显性分离，两条特异条带的大小为200，170 bp，结果见图2。该引物可用来鉴定杂交种质资源的纯度。

2.3 利用SSR鉴定青花菜杂交种纯度的评价

在试验田中，对随机选取的108株青花菜的茎、花球、叶片进行调查分析和形态学鉴定。鉴定结果表明，108株青花菜中有2株青花菜的茎、叶片、花球与母本的表现型不一致，通过田间形态学鉴定的结果表明，‘津青一号种子纯度为98.15%。对随机选取的108株植株用已筛选出的SSR引物扩增进行鉴定分析。发现：其中有4株为混杂品种，经鉴定津青一号种子的纯度为96.30%，引物扩增的部分结果见图3。

2.4 对杂交种子的检验

利用筛选得到的SSR引物对随机选取的300粒‘津青一号商品种子进行纯度检测，PCR扩增结果表明，引物在其中295粒中均表现出共显性分离，有5粒为混杂种子，纯度为98.33%，符合国家标准。

3 结论与讨论

3.1 SSR引物

合成的50对引物是根据GenBank网站上公布的青花菜EST序列设计的，经过验证发现，有43对SSR引物在青花菜中可扩增出有效条带。SSR分子标记是以PCR技术为基础的，条带相对单一、稳定，操作简单，成本较低。筛选出可用于鉴定杂交F1代的SSR分子标记，较形态学鉴定能有效减少鉴定的周期和成本，能快速准确地鉴定杂交F1代种子的纯度。

3.2 SSR分子标记鉴定种子纯度

杂交种子的纯度在很大程度上影响了青花菜的品质和产量，在种子生产中由于一些不可避免的因素影响，造成了个别品种种子的混杂，使得种子的纯度受到影响。种子鉴定的传统方法即大田形态观察法的周期长，形态区分的难度较大，易造成种子鉴定的准确度有偏差。分子标记的出现使得种子纯度的鉴定周期缩短，稳定性提高，准确度得到保证。王立新等[12]利用SSR、EST-SSR和AFLP-SCAR对400个小麦品种进行鉴定研究，推荐了7对SSR引物、5对EST-SSR引物和3对AFLP-SCAR引物为检测种子纯度的核心引物；林珲等[13]应用RAPD标记对苦瓜种子进行纯度鉴定，筛选出1个引物S115；王全等[14]利用SSR分子标记对黄瓜种子进行纯度鉴定，筛选出1对可用的SSR引物。本研究以11DR-100、10FS-2、津青一号为材料，用50对SSR引物对其扩增。在有效的43对引物中，经过筛选得到1对在F1代中能产生与亲本互补带型的引物L21。在大田中随机抽取108个津青一号样品，对这些样品分别进行大田形态学鉴定和SSR分子标记鉴定。对108株青花菜的茎、花球、叶片进行调查分析和形态学鉴定，结果表明津青一号种子纯度为98.15%；利用筛选出的SSR引物L21对108个‘津青一号样品进行鉴定分析，结果表明F1代‘津青一号种子的纯度为96.30%：说明SSR分子标记筛选方法更能准确鉴别‘津青一号种子的纯度。

在大田形态法鉴定的过程中，受局部生长环境不同、光照不均的影响，使青花菜不同品种间的形态差异不显著，所以会造成一些不纯品种未被鉴定出来；而SSR分子标记筛选能避免外界因素的影响，在DNA水平上对青花菜种子的纯度进行评价，不但缩短了鉴定周期且提高了准确度。

利用SSR分子标记鉴定种子纯度的方法也可应用于其他经济作物，如甜瓜、水稻、小麦等[15-17]。分子标记的应用节省了种子鉴定的经费和时间，分子标记在种子鉴定方面有应用的价值。

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