氟中毒对小鼠精子ATP的影响

李素娟，张雯，张孝清，孙子龙

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801；3.朔州职业技术学院生物工程系，山西朔州036002）

氟中毒对小鼠精子ATP的影响

李素娟1，张雯2，张孝清3，孙子龙1

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801；3.朔州职业技术学院生物工程系，山西朔州036002）

为探讨氟化钠对雄性小鼠精子ATP的影响，将24只雄性小鼠随机分为对照组（供给蒸馏水）、低氟组（供给含25 mg/L NaF的蒸馏水）、中氟组（供给含50 mg/L NaF的蒸馏水）、高氟组（供给含100 mg/L NaF的蒸馏水），180 d后检测小鼠精子在有氧呼吸与无氧酵解中产生的ATP含量。结果表明，氟化钠能够降低小鼠不同呼吸模型下精子ATP含量。氟化钠能够降低小鼠精子ATP含量，主要是通过改变有氧呼吸产生ATP的能力发挥作用。

氟中毒；精子；ATP

氟可以突破血睾屏障和血-附睾屏障，可以破坏其结构，使代谢功能等受到损伤，导致生精功能和精子生存的内环境发生改变[1]，进而对睾丸的生精细胞、支持细胞及精子产生毒副作用[2]。研究表明，机体摄入过量氟可导致睾丸生精功能降低，使精液质量下降，不育率升高[3]。

本试验通过建立线粒体有氧呼吸与无氧酵解模型检测小鼠精子在不同呼吸途径中所产生的ATP含量，从而为进一步阐明氟的生殖毒性奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验动物

24只昆明小鼠，雄性，8周龄（体质量为20～ 25 g），购自山西医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂

氟化钠（NaF，AR，天津市化学试剂三厂）；GENMED精子细胞BWW培养液（上海杰美基因医药科技有限公司）；CCCP（碳酰氰基-对-氯苯腙，美国SIGMA公司）；丙酮酸钠（美国AMRECSO）；D-无水葡萄糖（美国AMRESCO）；ATP检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计小鼠适应性饲养7 d后，随机分成4组，每组6只，分笼饲养，分为对照组、低氟组、中氟组、高氟组。对照组饮用蒸馏水，低、中、高氟组分别供给含25，50，100 mg/LNaF的蒸馏水。饲养环境干净整洁，小鼠自由饮水、采食。

1.3.2 小鼠骨骼中氟含量的测定饲养180 d，各组小鼠断颈处死，摘取小鼠股骨，在鼓风干燥箱中105℃烘烤4 h，烘烤结束后，将其放在通风橱内的电炉上灼烧至无烟，稍冷移入灰化炉中在560℃下灰化3～4 h，用离子浓度测量仪检测骨灰中氟的浓度。

1.3.3 小鼠精子的采集及前处理180 d后，无菌剖腹小鼠，立即切取小鼠附睾尾与输精管（尽量剔除其表面脂肪及网膜），放入盛有1 mLPBS和50 μL BWW（37℃预热）的小平皿中，用眼科剪将其剪碎，用1 mL注射器将悬浮液轻轻吹打5次，使精子充分游离出来，静置2 min，并将其吸入1.5 mL EP管中，备用。

1.3.4 小鼠精子呼吸模型的建立取部分采集好的精子，加入2 μL（5 mmol/L）丙酮酸钠溶液建立线粒体有氧呼吸模型，并将其转移至一个新的EP管中，待测ATP含量；同时，取部分精子，加入葡萄糖（5 mmol/L）和CCCP（1 μmol/L）各2 μL建立无氧酵解模型，待测相应呼吸模型下ATP含量[4-5]。

1.3.5 小鼠精子在不同呼吸模型下ATP含量的测定取1.3.4已建立呼吸模型的精子100 μL，严格按照ATP检测试剂盒的说明书操作，利用全波长多功能酶标仪（Thermo公司）检测ATP含量。

1.4 统计方法

试验结果采用GraphPad Prism 5统计软件的one-wayanalysis ofvariance（ANOVA）方法进行Dunnett检验，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠骨骼中氟的含量分析

从图1可以看出，与对照组相比，染氟组随着氟化钠浓度的增加，骨氟的含量逐渐升高，且与对照组相比，低、中、高氟组骨氟含量差异达极显著。

2.2 氟对小鼠精子ATP含量的影响

2.2.1 小鼠精子总ATP含量小鼠精子在正常呼吸作用下，ATP总含量如图2所示。由图2可知，随着NaF浓度的增加，小鼠精子总ATP含量呈下降趋势，且低氟时总ATP含量显著下降，中、高氟组呈极显著下降。

2.2.2 有氧呼吸模型下小鼠精子ATP含量在氟化钠的作用下，小鼠精子有氧呼吸模型下ATP的含量如图3所示。由图3可知，与对照组相比，随着NaF浓度的增加，小鼠精子ATP的含量总体呈下降趋势，低、中氟组ATP含量显著下降，高氟组呈极显著下降。

2.2.3 无氧酵解模型下小鼠精子ATP含量在氟化钠的作用下，小鼠精子无氧酵解ATP含量如图4所示。由图4可知，与对照组相比，随着NaF浓度的增加，小鼠精子ATP的含量总体呈下降趋势，但仅高氟组显著下降，低、中氟组无显著变化。

3 讨论

氟中毒的主要临床症状表现为氟斑牙和氟骨症[6-7]。氟化物的亲骨性很强，机体吸收的氟大部分都蓄积到骨骼中。骨氟含量是反映体内氟蓄积状况的最好指标。本试验选用小鼠股骨作为试验对象，利用离子浓度测量仪检测小鼠骨骼中氟的含量，结果表明，随着饮水中氟浓度的升高，小鼠股骨中氟的含量呈极显著升高。

氟化物可直接损害精子，使完整的精子溢出钾离子，抑制Na+/K+泵，干扰精子线粒体膜电位[8]，使精子电解质失衡，进而损害精子的形态和功能[9]。Chinoy等[10-11]研究表明，氟化物可使小鼠附睾尾中精子活率、活力、密度均下降，出现大量的畸形精子，并且精子的顶体功能也减弱，顶体素和透明质酸酶含量下降，精子的形状与代谢发生变化，精子线粒体的活性下降。氟中毒还可使小鼠精子的超激活运动能力[12]、趋化性功能明显降低[13]，且其损伤程度随着染氟剂量的增加而加大。氟化物会诱导精子产生活性氧，而过多活性氧会导致氧化应激，严重影响精子质膜流动性，危害精子获能、精卵识别和受精过程，同时破坏精子DNA完整性，常引起不育或者围产期流产。但至今仍鲜有报道系统性阐述亚慢性氟中毒对精子线粒体有氧呼吸和无氧酵解的影响。

解偶联剂CCCP（碳酰氰基-对-氯苯腙）可以抑制精子线粒体有氧呼吸作用产生ATP[14]。Hereng等[15]在人体精子中加入外源的丙酮酸钠，发现精子细胞内ATP水平明显提高，同时线粒体的氧化磷酸化能力明显增强。因此，本试验选择在精子细胞培养液中加入丙酮酸钠建立线粒体有氧呼吸模型；在精子细胞培养液中加入葡萄糖和CCCP诱导无氧酵解，建立无氧呼吸模型。结果表明，与对照组相比，随着NaF浓度的增加，小鼠精子总ATP含量总体呈下降趋势，且主要通过影响有氧呼吸发挥作用。这些结果可能与氟离子能够抑制酶的活性中心相关。Chinoy等[16]研究证明，染氟可导致家兔精子的三磷酸腺苷酶（ATPase）、琥珀酸脱氢酶（SDH）和酸性磷酸酶（ACP）的活性下降，而ATPase，SDH，ACP均是能量代谢的重要酶系。其具体机制还有待于今后进一步研究。

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Effect of Fluoride on Sperm ATP in Mice

LI Su-juan1，ZHANGWen2，ZHANGXiao-qing3，SUNZi-long1
（1.College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.College ofFood Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；3.Department ofBiological Engineering，Shuozhou Vocational Technical College，Shuozhou 036002，China）

To study the effect of sodium fluoride on the ATP of sperm in male mice,24 male mice were randomly divided into control group,lowfluoride group,medium fluoride group,and high fluoride group.The four groups were orally administrated with 0,25, 50,100 mg/L NaF for 180 d.Glycolysis and mitochondrial respiration models were established for the detection of ATP content.The results showed that the sodium fluoride could reduce different breathing sperm ATP content in mice,through the change in the ATP produced bymitochondrial respiration.

fluoride;sperm;ATP

S859.8

A

1002-2481（2016）04-0480-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.04.14

2015-12-11

国家自然科学基金项目（31201965）；山西农业大学科技创新基金项目（201203）；山西农业大学青年拔尖创新人才支持计划项目（TYIT201408）

李素娟（1991-），女，山西运城人，在读硕士，研究方向：环境兽医学及营养代谢病。孙子龙为通信作者。