黄花蒿酵解液联合多西他赛对乳腺癌耐药细胞MCF-7/DTX 逆转作用的研究

2022-07-19李燕寇晓梅柯永莉

海军医学杂志 2022年4期

李燕，寇晓梅，柯永莉

乳腺癌作为女性多发的恶性肿瘤，发病率逐年升高，由于发病因素目前无确定的机制且受到多种因素的影响，环境因素引起相关基因发生突变，饮食习惯与饮食结构的改变和体内性激素水平异常升高都会引起乳腺癌的发病风险升高。目前乳腺癌主要的治疗手段为放疗、化疗、内分泌治疗及生物靶向治疗［1］。化疗药物通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用，有效控制疾病进程，能够有效地改善患者的生活质量，有效增长患者的生存年限。但同时也会引起调控基因表达的失控，导致肿瘤细胞的耐受产生多药耐药性［2］。多西他赛（docetaxel，DTX）通过与β-微管蛋白结合发挥作用，阻滞肿瘤细胞有丝分裂，导致细胞死亡［3］。黄花蒿（Artemisia annua L）的主要成分青蒿素（Artemisinin）具有诱导细胞凋亡的能力，并且具有对抗多药耐药的能力。为寻找具有临床应用价值的逆转剂，本研究探究了黄花蒿酵解液联合多西他赛对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DTX 的逆转作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人乳腺癌细胞MCF-7 由广州军区广州总医院医学实验科细胞室提供，人乳腺癌多西他赛耐药细胞株MCF-7/DTX由实验室低浓度梯度诱导培养，传代2～3 周后，细胞呈指数生长后进行实验。

1.2 材料仪器与设备

高糖型（DMEM-H）细胞培养基：DME H-21、4.5 g/L 葡萄糖、10%新生牛血清，新生牛血清，胰蛋白酶，多西他赛RPM I-1640 培养液，0.2 μm 过滤膜，黄花蒿酵解液由实验室制备，四甲基偶氮唑蓝，二甲亚砜，人多药耐药蛋白（multi-drug resistance protein1，MDR1）Elisa 试剂盒，多药耐药相关蛋白1（multi-drug resistance-associated protein1，MRP1）Elisa 试剂盒，乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）Elisa 试剂盒，肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein，LRP）Elisa 试剂盒。

1.3 仪器

恒温二氧化碳细胞培养箱，超净工作台，荧光分析酶标仪。

2 方法

2.1 黄花蒿酵解液的制备

2.1.1 准备将浸泡后的糯米蒸熟，倒入冷水使温度降至28～30 ℃，后将其放入缸里，将酒药一并倒入到缸里，搓散糯米，搭醅挖凹，底面直径约15 cm，米上再薄撒一层酒药，经24～30 h 后酿液浸出，缸内温度降至室温24 h 后，酿块浮起，按比例加入冷水、切块及翻转［4］。

2.1.2 初步发酵 48 h 后倒入蒸熟米，黄花蒿叶末，加曲拌匀，进行发酵。过12～18 h 后排除二氧化碳（CO2），72 h 后重复上述步骤拌缸

2.1.3 慢发酵 96 h 后，灌入小埕，液面距口10 cm，扎好埕口，在低温、低氧环境下保存。

2.1.4 制备 90 d 后取上清液，离心30 min（3 000 r/min，r=8 cm），0.2 μum 过滤膜过滤，得酵解液。

2.1.5 配制工作液将细胞酵解液分别稀释成10 g/L，20 g/L，30 g/L，40 g/L。

2.2 细胞培养

2.2.1 接种将MCF-7 细胞接种在细胞培养基上，置培养基于37 ℃，CO2体积分数为5%的细胞培养箱中。

2.2.2 换液 2～3 d 后当培养基颜色变化，将其置于无菌操作台，打开瓶口，将其中的培养液去掉，再往其中加入5～6 ml 新鲜培养基，然后再放到细胞培养箱中培养。

2.2.3 传代培养当细胞贴壁生长80%左右清洗，弃去上清液，将0.25% 胰蛋白酶37 ℃预热后加入，3～5 min 后吸去胰酶，用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后吸取加入到新的培养基中进行传代。

2.3 配制DTX 细胞液

用RPM I-1640 培养液稀释多西他赛注射液，至浓度为0.5 μg/L，准备使用。

2.4 建立耐药株MCF-7/DTX 模型

取对数生长周期的约1×107个MCF-7 细胞，将0.5 μg/L DTX分别稀释至0.01 μg/L，0.02 μg/L，0.05 μg/L，0.1 μg/L，0.2 μg/L，首先用0.01 μg/L DTX 细胞液培养MCF-7 细胞，72 h后弃去培养基的上清液洗净，继续用0.02 μg/L DTX 诱导MCF-7 细胞，重复以上步骤进行浓度逐步到0.5 μg/L，进行递增性诱导［5］，最终维持培养在0.5 μg/LDTX 细胞液中。

2.5 测定不同浓度黄花蒿酵解液作用后DTX 对MCF-7/DTX 细胞的增殖抑制率

取1×105/ml MCF-7/DTX 细胞悬液，接种96 孔板，每孔100 μl，按照加入不同浓度黄花蒿酵解液对MCF-7/DTX 分组，A 组为对照组，不加药物。B 组加入10 g/L 黄花蒿酵解液，C 组加入20 g/L 黄花蒿酵解液，D 组加入30 g/L 黄花蒿酵解液，E 组加入40 g/L 黄花蒿酵解液。置37 ℃、5%CO2及饱和湿度的条件下细胞培养箱培养过夜。待其贴壁后，每组分别加入DTX 使其终浓度1、2、3、4 μg/ml，每个浓度设3 个复孔，每孔终体积为200 μL。对照组不加DTX，加入等量的DMEM 培养液。培养48 h 后，每孔中加入5 mg/ml 的噻唑蓝（MTT）20 μl，继续培养4 h。离心去上清液，每孔加入DMSO 150 μl 溶解结晶颗粒。用酶标仪于490 波长测定吸光度（A），计算不同浓度的DTX 对MCF-7/DTX 细胞的增殖抑制率，实验重复3 次。增值抑制率=1-（实验组平均吸光值/对照组平均吸光值）×100%［6］。

2.6 测定黄花蒿酵解液对MCF-7/DTX 细胞的耐药逆转的影响

采用综合计算法，计算出半数抑制率的DTX 浓度（IC50）。细胞耐药逆转指数=对照组细胞IC50/实验组细胞IC50。

2.7 MDR1 Elisa 试剂盒检测MRP1 水平

取ABCDE 细胞上清液稀释，在孔底先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl 加样将样品加于孔底部，轻轻晃动混匀，用封板膜封板后置37 ℃温育30 min，每孔加满洗涤液，静置30 s 后弃去，每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外。再次温育洗涤，每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。再加入终止液50 μl 终止反应，以空白孔调零，用酶标仪450 nm 测量各孔的吸光度（OD 值），每个待测样品，阳性液，阴性液设3 个复孔，空白孔1 个。

2.8 MRP1 Elisa 试剂盒检测MRP1 水平

在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50 μl，在其他孔中加入抗体稀释液40 μl，取ABCDE 5 组的隔夜培养细胞样品上清液10 μl，加于酶标板孔底部，用封板膜封板后置37 ℃温育30 min，将20 倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600 ml后备用，揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s 后弃去，如此重复5 次，拍干，每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外。每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加50 μl终止液终止反应，以空白孔调零，用酶标仪测量各孔在450 nm的吸光度（OD 值）。每个待测样品，阳性液，阴性液设3 个复孔，空白孔1 个。

2.9 BCRP Elisa 试剂盒检测BCRP 水平

每板设阴性对照3 孔、阳性对照3 孔、空白对照1 孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，用缓冲液将抗体稀释至1～10 μg/ml。在反应孔中加0.1 ml 抗体，4 ℃下过夜，次日弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3 次，加一定稀释的6 组样品，阴性试剂，阳性试剂0.05 ml 于上述已包被的反应孔中，每个样品设置3 个复孔，置37 ℃孵育1 h 洗涤，加入新鲜稀释的酶标抗体0.05 ml。37 ℃孵育0.5～1 h，洗涤，于各反应孔中加入临时配制的TMB 底物溶液0.1 ml，置于37 ℃下10～30 min 后，在各反应孔中加入2M 硫酸0.05 ml 终止反应，在ELISA 检测仪上，于450 nm 以空白对照孔调零后测各孔OD 值。

2.10 LRP Elisa 试剂盒检测LRP 水平

用标本稀释液1:1 稀释后加入50 μl 于反应孔内，再加入ABCDE 5 组样品50 μl，每个样品设置3 个复孔，加入后立即加入50 μl 的生物素标记的抗体，盖上膜板，轻轻振荡混匀，37 ℃温育1 h，甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3 次，每孔加入80 μl 的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min，甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3 次，每孔加入底物A、B各50 μl，轻轻振荡混匀，37 ℃温育10 min。避免光照，取出酶标板，迅速加入50 μl 终止液，加入终止液后应立即测定在450 nm 波长处测定各孔的OD 值，每个待测样品，阳性液，阴性液设3 个复孔，空白孔1 个。

3 统计学处理

采用SPSS 25.0 软件对研究数据其进行统计和分析，计量单位采用±s表示，组间两两差异比较采用Dunnett-t 检验，组间差异采用t检验，计数单位用χ2检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

4 结果

4.1 黄花蒿酵解液对MCF-7/DTX 细胞的耐药逆转

不同浓度的黄花蒿酵解液可以增强细胞逆转作用，减少MCF-7/DTX 的耐药程度，黄花蒿酵解液浓度越高，细胞增殖抑制率越高，逆转作用越明显（P＜0.05），见表1。随着黄花蒿酵解液的浓度升高，半数抑制浓度逐渐降低，逆转指数逐渐升高（P＜0.05），见表2。

表1 不同浓度黄花蒿酵解液作用后DTX 对MCF-7/DTX细胞增殖抑制率的影响（%，± s）

注：DTX 为多西他赛

组别无DTX A 组（对照组）B 组（MCF-7/DTX+10 g/L 黄花蒿酵解液）C 组（MCF-7/DTX+20 g/L 黄花蒿酵解液）D 组（MCF-7/DTX+30 g/L 黄花蒿酵解液）E 组（MCF-7/DTX+40 g/L 黄花蒿酵解液）P 值0.23±0.01 11.37±0.02 DTX 浓度1 μg/ml 12.40±0.02 13.43±0.23 DTX 浓度2 μg/ml 14.67±0.21 17.56±0.11 DTX 浓度3 μg/ml 19.38±0.05 26.77±0.13 DTX 浓度4 μg/ml 24.78±0.02 30.65±0.03 43.57±0.11 53.32±0.14 56.63±0.23 60.34±0.11 64.65±0.07 74.22±0.04 78.64±0.15 80.45±0.13 88.39±0.21 90.49±0.03 82.53±0.11 87.43±0.05 89.34±0.07 91.85±0.14 93.28±0.11＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表2 不同浓度黄花蒿酵解液作用对MCF-7/DTX细胞逆转的影响（± s）

注：DTX 为多西他赛

组别A 组（对照组）B 组（MCF-7/DTX+10 g/L 黄花蒿酵解液）C 组（MCF-7/DTX+20 g/L 黄花蒿酵解液）D 组（MCF-7/DTX+30 g/L 黄花蒿酵解液）E 组（MCF-7/DTX+40 g/L 黄花蒿酵解液）P 值IC50 0.92±0.01 0.84±0.03 0.65±0.03 0.46±0.02 0.33±0.01 0.009逆转指数1.11 1.37 1.88 2.79

4.2 黄花蒿酵解液对MDR1 水平的影响

经不同浓度的黄花蒿酵解液处理后，MCF-7/DTX 细胞的MDR1 水平显著低于对照组。黄花蒿酵解液浓度越高，MDR1 的水平越低，对MDR1 的抑制程度越高（P＜0.05），见表3。

表3 不同浓度黄花蒿酵解液对MCF-7/DTX细胞MDR1 水平的影响（± s）

注：DTX 为多西他赛，MRP1 为多药耐药相关蛋白，OD 为吸光度

组别阴性组A 组（对照组）B 组（MCF-7/DTX+10 g/L 黄花蒿酵解液）C 组（MCF-7/DTX+20 g/L 黄花蒿酵解液）D 组（MCF-7/DTX+30 g/L 黄花蒿酵解液）E 组（MCF-7/DTX+40 g/L 黄花蒿酵解液）阳性组OD（MRP1）0.14±0.02 2.78±0.12 1.87±0.07 1.42±0.01 0.72±0.04 0.24±0.02 0.72±0.06 P 值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

4.3 黄花蒿酵解液对MRP1 水平的影响

经不同浓度的黄花蒿酵解液处理后，MCF-7/DTX 细胞的MRP1 水平显著低于对照组。黄花蒿酵解液浓度越高，MRP1 的水平越低，对MRP1 的抑制程度越高（P＜0.05），见表4。

表4 不同浓度黄花蒿酵解液对MCF-7/DTX细胞MRP1 水平的影响（± s）

注：DTX 为多西他赛，MRP1 为多药耐药相关蛋白，OD 为吸光度

组别阴性组A 组（对照组）B 组（MCF-7/DTX+10 g/L 黄花蒿酵解液）C 组（MCF-7/DTX+20 g/L 黄花蒿酵解液）D 组（MCF-7/DTX+30 g/L 黄花蒿酵解液）E 组（MCF-7/DTX+40 g/L 黄花蒿酵解液）阳性组OD（MRP1）0.12±0.01 2.33±0.21 1.92±0.03 1.25±0.16 0.55±0.10 0.24±0.02 0.80±0.01 P 值0.002＜0.01＜0.01＜0.01

4.4 黄花蒿酵解液对BCRP 水平的影响

经不同浓度的黄花蒿酵解液处理后，MCF-7/DTX 细胞的BCRP 水平显著低于对照组。黄花蒿酵解液浓度越高，MRP1 的水平越低，对BCRP 的抑制程度越高（P＜0.05），见表5。

表5 不同浓度黄花蒿酵解液对MCF-7/DTX细胞BCRP 水平的影响（± s）

注：DTX 为多西他赛，BCRP 为乳腺癌耐药蛋白，OD 为吸光度

组别阴性组A 组（对照组）B 组（MCF-7/DTX+10 g/L 黄花蒿酵解液）C 组（MCF-7/DTX+20 g/L 黄花蒿酵解液）D 组（MCF-7/DTX+30 g/L 黄花蒿酵解液）E 组（MCF-7/DTX+40 g/L 黄花蒿酵解液）阳性组OD（BCRP）0.19±0.02 2.40±0.07 1.67±0.04 1.36±0.12 0.52±0.08 0.24±0.03 0.76±0.02 P 值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

4.5 黄花蒿酵解液对LRP 水平的影响

经不同浓度的黄花蒿酵解液处理后，MCF-7/DTX 细胞的LRP 水平显著低于对照组。黄花蒿酵解液浓度越高，LRP的水平越低，对LRP 的抑制程度越高（P＜0.05），见表6。

表6 不同浓度黄花蒿酵解液对MCF-7/DTX细胞LRP 水平的影响（± s）

注：DTX 为多西他赛，LRP 为肺耐药蛋白，OD 为吸光度

组别阴性组A 组（对照组）B 组（MCF-7/DTX+10 g/L 黄花蒿酵解液）C 组（MCF-7/DTX+20 g/L 黄花蒿酵解液）D 组（MCF-7/DTX+30 g/L 黄花蒿酵解液）E 组（MCF-7/DTX+40 g/L 黄花蒿酵解液）阳性组OD（LRP）0.15±0.02 2.67±0.11 1.75±0.02 1.52±0.01 0.69±0.03 0.27±0.01 0.75±0.02 P 值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

5 讨论

2020 年，全球乳腺癌新发病例高达226 万例，超过了肺癌的220 万例，乳腺癌取代肺癌，成为全球第一大癌［7］。乳腺癌是一种由多种因素引起的恶性肿瘤，首要因素是由于家族遗传引起的恶性肿瘤。近年女性进行人工流产的人数增多，女性在终止妊娠时乳腺组织容易受到致癌物的影响。同时口服避孕药成为常见的避孕方式，使乳腺癌的患病风险增加。伴随人们生活水平提高而来的是饮食营养结构的改变，高脂肪高热量的饮食习惯，超重或者肥胖都会引起乳腺癌的发病风险升高［8］。

随乳腺癌诊疗水平的提高与治疗方法的多样化，5 年生存率已高达90%［1］，化学药物治疗中多西他赛与其他药物相比有其优越性，一是人体内代谢多西他赛需要较长时间，达峰浓度高，故多西他赛经过体内代谢降低至无效浓度的历经时间长，发挥作用时间长［9］。二是服用多西他赛后出现过敏等不良反应的几率低，安全性较高［10］。多西他赛通过加强微管蛋白聚合，抑制微管蛋白的解聚发挥作用，细胞的有丝分裂需要微管聚合和解聚的正常动态平衡，故微管解聚产生的拉力无法产生，染色体无法向两极移动，从而抑制了癌细胞分裂和增殖［11］。但多西他赛在长期用药后会产生多药耐药性，目前耐药机制的产生与通透性糖蛋白（P-gp）高表达有关，P-gp 是一种跨膜蛋白，能够将吸收进细胞内的多种化疗药物出体外，从而产生多药耐药性，与P-gp 功能相同的是，BCRP 和MRP 均属于药物排出泵，可以将吸收的各种化疗药物泵出体外，产生细胞多药耐药［12］。细胞外排药物的机制不仅通过细胞膜上的药泵，还可以通过囊泡转运到细胞外，这种通过胞吐机制外排药物受LRP 基因的调控，LRP 也是众多与多药耐药相关基因的一种，多西他赛使用后也会表现LRP 高水平表达，据相关研究，LRP 表达的蛋白LRP 表达的蛋白先使进入核孔的药物进入胞质，继续使药物进入囊泡从而排到细胞外［13］。多药耐药的发生使得药物失去药效，乳腺癌患者的生存率降低，临床为增加患者的生存时间积极寻找耐药细胞逆转剂，增加药物的疗效，提高患者生存率。

肿瘤化疗药物诱导的多药耐药通过多种信号通路产生，目前发现的许多逆转多药耐药的药物长期使用后，毒副作用大或者抑制效率很低，在临床上很难推广，因为西药逆转剂往往只能针对其中的一种耐药机制进行逆转，因此逆转效率不高。黄花蒿中富含青蒿素［14］，青蒿素对正常细胞的杀伤力很小，对肿瘤细胞的杀伤力强，并且青蒿素是中药，与抗肿瘤的西药不存在相同的化学结构，与传统西药协同作用，增强药物的抗肿瘤作用。另一方面青蒿素能够抑制谷胱甘肽转移酶的活性，肿瘤细胞内谷胱甘肽转移酶水平与细胞的敏感性成正相关，细胞内谷胱甘肽转移酶的活性降低后MDR1、MRP1，BCRP 和LRP 高表达发生逆转［15］，青花蒿酵解液中的成分多样，同时抑制体内多种信号通路靶点。故青花蒿酵解液不仅低毒，而且作用高效，具有广阔前景。

本研究显示，经过不同浓度的黄花蒿酵解液处理后，细胞增殖抑制率得到升高，多西他赛对肿瘤细胞的抑制作用得到增强，黄花蒿酵解液与多西他赛联合，相互协同发挥作用，黄花蒿酵解液可以增强细胞逆转作用，减少MCF-7/DTX 的耐药程度，黄花蒿酵解液浓度越高，细胞增殖抑制率越高，逆转作用越明显随着黄花蒿酵解液的浓度升高，半数抑制浓度逐渐降低，逆转指数逐渐升高。黄花蒿在抗多药耐药也具有其强效的作用，经过不同浓度的黄花蒿酵解液处理后，MCF-7/DTX 细胞的MDR1，BCRP，LRP 的表达水平显著低于对照组。黄花蒿酵解液的浓度越高，MDR1，BCRP，LRP 的水平越低，对MDR1，BCRP，LRP 的抑制程度越高。

综上所述，花蒿酵解液联合多西他赛可以逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DTX 对多西他赛的耐药性，增强MCF-7/DTX 对多西他赛的敏感性。