主动外排机制和膜蛋白缺失在阴沟肠杆菌耐药中的研究

扈会整，苏庚询，张晔婷，任伟娟，文 杏，任超杰，王 婵

(陕西省核工业二一五医院，陕西 西安712000)

主动外排机制和膜蛋白缺失在阴沟肠杆菌耐药中的研究

扈会整，苏庚询，张晔婷，任伟娟，文 杏，任超杰，王 婵

(陕西省核工业二一五医院，陕西 西安712000)

阴沟肠杆菌是医院感染的重要病原菌，由于头孢菌素等广谱抗菌药物的广泛使用，阴沟肠杆菌的耐药水平不断增加，此菌具有染色体介导的bush I(AmpC)[1]型β-内酰胺酶(又称诱导酶或C类头孢菌素酶)，常在治疗过程中产生多重耐药[2，3]，多重耐药的阴沟肠杆菌引起的菌血症有很高的病死率。给临床治疗和院内感染控制带来了极大的挑战[4]。阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制，是否与细胞内存在主动外排机制和膜蛋白缺失有关，我们对此作了相应的试验和基因分型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源与质控菌株 2012年6月至2013年5月从我院临床各种感染患者的标本中共分离获得不重复的100株阴沟肠杆菌，其中耐碳青霉烯酶的菌株20株。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922，ATCC13047。

1.1.2 试剂和设备 M-H培养基(杭州天和)；菌种及药敏鉴定使用VITEK-2全自动细菌药敏鉴定系统及配套试剂(购于法国生物梅里埃公司)；PCR扩增试剂购于上海生物工程有限公司；100 bp DNA梯带标志物(大连宝生物)，Eppendorf centrifuge5417R低温离心机，MJ Peltier Thermal Cycler(MJ Research)，Bio-Rad电泳仪，Bio-Rad凝胶成像系统，氰氯苯腙(CCCP)终浓度5 mg/L(Sigma)，IMP Etest试条(0.002-32tlg/m1)(瑞典AB Biodisk)，琼脂糖(英国Oxoid公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCCP(氰氯苯腙)抑制作用 CCCP对主动外排泵表型特征的影响配制水解酪蛋白(M-H)琼脂和含CCCP(终浓度5 mg/L，该浓度对外排泵有较好抑制作用，而对细菌生长无影响)的M—H琼脂平皿，挑取2-3个过夜培养的菌落，用生理盐水调至0．5麦氏单位，按照K-B法标准操作程序涂布菌悬液和贴Etest试条，放35℃培养24 h，观察CCCP对IMP和MPM的MIC的逆转作用。当存在CCCP时IMP和MPM的MIC值比缺乏时相应的MIC下降至原值的1/3，说明提示主动外排机制存在。

1.2.2 基因检测方法 acrAB的循环条件：预变性94℃-5 min、变性94℃-30sec、退火58℃(54℃)-30sec、延伸72℃-40sec、再延伸72℃-10 min,共循环35周。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由上海生物工程公司提供。应用PCR方法，并用琼脂糖凝胶电泳成像，在凝胶成像系统中观察结果并采集图像。引物序列见下表1。

表1 基因引物序列

1.2.3 外膜蛋白分析 收集200 ml过夜培养的菌液，超声波破碎细菌3000转4℃离心10 min去除未破碎的细菌，离心10000转90 min收集沉淀物。用含十二烷基硫酸钠缓冲液重新沉淀，室温放置1 h，重复该两步骤得到沉淀物备用。缓冲液与外膜蛋白混匀后煮沸10 min，在电泳仪上进行尿素十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后用考马斯亮蓝染色。

2 结果

2.1 CCCP存在与否对IMP体外抗茵活性的影响 20株亚胺培南和美罗培南耐药的阴沟肠杆菌中，20均表现为外排泵表型试验阳性，CCCP存在使IMP MIC下降至4个浓度梯度的菌株有15株，下降至3个浓度梯度的菌株有5株，CCCP存在使MPM MIC下降至4个浓度梯度的菌株有12株，其中有12株菌同时对两种药物有明显的外排作用。

2.2 外排泵基因扩增检测结果 18株同时检测出acrA和acrB基因，目标片段为1 194 bp和800 bp,扩增产物电泳结果如图1。

注：1.acrB 2.acrA 3.阴性对照 4.Marker(2 000 bp) DNA梯带

2.3 外膜蛋白分析 外膜蛋白凝胶电泳分析如图2，标准菌株ATCC13047有四种蛋白，37 kDa条带为OmpA、38 kDa条带为OmpF、41 kDa条带为OmpC、47 kDa条带为LamB，其中38 kDa和41 kDa的条带与大肠埃希菌的OmpF和OmpC相对应，他们都是与耐药有关的膜蛋白。所测20株阴沟肠杆菌中，有5株38 kDa条带缺失，7株41 kDa条带缺失，同时缺失的有3株。如图2。

注：1.阴沟肠杆菌膜缺失标本 2.阴沟肠杆菌ATCC13047 3.蛋白质分子量标准

图2 外膜蛋白凝胶电泳分析

3 讨论

主动外排是一种特殊的能量依赖系统，能使进入体内的药物蹦出体外，从而使体内的药物浓度不足而导致耐药。其中AcrAB-TolC[5]的外排系统在革兰阴性菌多重耐药过程中发挥着重要作用，能排出多种结构上不相同的化合物。其他的外排泵也可能有此功能，但是大多数是不表达的，Astrid Perez[6]等对这个系统进行了测序分析，发现acrA，acrB和acrR基因的序列和铜绿假单胞菌有很高的同源性，所以外排泵AcrAB-TolC这个系统在临床分离菌株多重耐药中起着重要的作用。S.Pournaras[7]等研究，外排泵表达在铜绿假单胞菌美罗培南和亚胺培南耐药中的作用。CCCP为质子泵抑制剂的代表制剂，能破坏细菌跨胞浆膜的质子梯度，导致转运蛋白失去能量供应而起作用。一般认为CCCP作用使阴沟肠杆菌对IMP的MIC下降至1/3，表明细菌可能存在泵出机制，我们研究的20株阴沟肠杆菌外排泵表型试验阳性，此系统可以将已进入细菌胞质的抗菌药物排出菌体外，使之治疗失败 。说明主动外排系统是我们研究本地区阴沟肠杆菌耐药的主要机制。

细菌的膜蛋白及形成管道是细菌与外界进行交流的路径，也是抗生素透过细菌细胞膜的重要通道，细菌膜蛋白的缺失可阻止抗生素进入细菌，从而引起细菌对抗生素的耐药。研究发现与亚胺培南耐药有关的为外膜孔蛋白(OprD2)，外膜蛋白孔道是小分子的亚胺培南选择性快速进入菌体的特异性通道，也允许带有阳性电子基团的各种糖类及碱性氨基酸非特异扩散。不仅能形成亚胺培南的特异结合位点，同时发现碱性氨基酸为亚胺培南的竞争性抑制剂。外膜通透性下降 ，外膜蛋白的改变或减少 ，使抗菌药物进入细菌的通道减少或缺失，本研究20株耐碳青霉烯类药物的阴沟肠杆菌有9株膜蛋白缺失，其中有5株38 kDa条带缺失，7株41 kDa条带缺失，同时缺失的有3株，oprD2 基因缺乏无，提示蛋白基因缺失不是本组耐药的主要原因，但不排除因基因突变或基因表达下调导致阴沟肠杆菌对IMP耐药。

总之，阴沟肠杆菌对常用抗菌药物耐药情况及对碳青霉烯类药物的耐药性机制复杂，主动外排机制存在是其重要的耐药基理。膜孔蛋白基因缺失也与其有重要的关系。

[1]Jacoby GA.AmpC beta-lactamases[J].Clin Microbiol Rev,2009,22(1)：161.

[2]洪秀华.临床微生物学检验[M].北京:中国医药科技出版社,2004.224.

[3]扈会整，刘 婧,刘汉芳.对多重耐药黏质沙雷菌的抗菌药物联合应用模式的初步研究[M].临床检验杂志，2012，5(30)390.

[4]Jean SS,Hsueh PR.High burden of antimicrobial resistance in Asia[J].Int J Antimicrob Agents,2011,37(4):291.

[5]Doi Y,Yokoyama K.Yamane K，et al．Plasmid-mediated 16S rRNA methylasein Serratia marcescens conferring high-level resistanceto aminog1ycosides[J]．Antimicrob Agents Chemother，2004，48(2)：491．

[6]Astrid perez,Delia Canle,Cristina Latasa,et al.Cloning,nucleotide sequencing,and analysis of the AcrAB-ToLC efflux pump of Enterobscter cloacae and determination of its involvement in antibiotic resistance in a clinical isolate[J].J Antimicrobial Chemotherapy,2007,51(9):3247.

[7]Poumaras S,Manaati M, Spanakis N,et al.Spread of efflux pump overexpressing,non-metallo-B-lactamase-producing,meropenem-resistant but ceftazidime suscepyible Pseudomonas aeruginosa in a region with blaVIM[J].J Antimicrobial Chemotherapy,2005,56:(4):761.

1007-4287(2016)12-2097-03

扈会整(1972-),女，副主任技师，检验科主任，研究方向:临床微生物检验与分子诊断。

2016-03-12)