DNA甲基化检测在结直肠癌诊断中的应用

白盈盈,朱光旭，潘兴华

(1.成都军区昆明总医院 细胞生物治疗中心、细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省干细胞工程实验室，云南 昆明650032；2.昆明医科大学 成都军区昆明总医院临床学院，云南 昆明650500)

DNA甲基化检测在结直肠癌诊断中的应用

白盈盈1,2,朱光旭1*，潘兴华1*

(1.成都军区昆明总医院 细胞生物治疗中心、细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省干细胞工程实验室，云南 昆明650032；2.昆明医科大学 成都军区昆明总医院临床学院，云南 昆明650500)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球男性第3、女性第2常见的恶性肿瘤，死亡率占全球癌症的第4位，每年约有69.4万人死于此病[1]。在中国，CRC的发病率呈现上升趋势，现已高居男女肿瘤发病率的第5位和第4位[2]。对于早期CRC患者，多数可以治愈，5年生存率可达90%，而对于晚期患者则不足10%[3]，然而多数CRC患者确诊时已到中晚期，早期CRC缺乏典型临床症状不易察觉，因此有效的早期诊断方法可以降低CRC的发病率和病死率以及提高患者生存率。目前，侵入性的结肠镜检查和粪便隐血试验(Fecal occult blood teats，FOBT)是CRC诊断的主要手段,但是FOBT缺乏特异性，难以满足结直肠癌诊断的要求。结肠镜检查的特异性可达95%，但属于侵入性检查，并且有高风险的并发症，难以在人群中进行大规模的筛查[4]，因此急需方便、准确的生物标志物应用于CRC的诊断。研究发现，在肿瘤形成过程中，表观遗传学改变可能比经典遗传学改变更早发生[5]。DNA甲基化作为表观遗传修饰的重要方式，与CRC的发生发展关系密切，且在癌症的早期阶段就已发生，使其可能成为CRC早期诊断的新型生物标记物。

1 DNA甲基化

DNA甲基化(DNA methylation)是在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，Dnmt)催化作用下，将 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)的甲基共价结合到胞嘧啶磷酸鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的 5’-末端，生成 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mc)的过程[6]。在哺乳动物中，70%-80% 的 CpG 位点发生 DNA 甲基化，剩余的分布于基因的启动子区处于未甲基化状态[7]。在肿瘤细胞基因组中，CpG岛呈现异常DNA甲基化状态，通过直接或间接作用抑制基因转录，从而影响基因表达[8]。

2 DNA甲基化检测与结直肠癌诊断的相关性

DNA甲基化与CRC的发生、发展密切相关。基因甲基化检测在CRC诊断的应用中，检测标本来源主要有局部组织、血浆以及粪便三类，大量文献基于这三种标本进行了基因甲基化检测用于CRC诊断的研究，结果表明基因甲基化检测对于CRC的诊断具有不同程度的敏感性和特异性(表1)，同时也提示单一依靠局部组织、血浆或粪便标本进行甲基化检测难以比较准确地实现CRC诊断。

3 CRC患者DNA甲基化检测

在CRC患者中，多种来源的标本，如血液、粪便、组织等中均检测到异常DNA甲基化,因此进行DNA甲基化检测在临床上对结直肠癌诊断可能具有较好的潜在价值[9]。迄今文献对于CRC诊断的DNA甲基化检测主要包括了一下几种方式：

3.1 组织DNA甲基化的检测

活体组织检查是肿瘤诊断的重要手段，肿瘤样本组织相比于血液、粪便等样本具有更早的发生率、更高的准确性，对CRC病变组织进行DNA甲基化检测有助于其准确的诊断。研究发现，结直肠癌组织、癌前病变中启动子区域基因甲基化阳性率高于远离结直肠癌的正常组织，表明活检组织基因启动子甲基化检测可以为CRC患者提供准确的早期病情判断和预后评估依据，具有广泛的临床应用价值[10]。但是，肿瘤组织标本相较于血液、粪便，其提取过程是侵入性的，且取材部位也能影响诊断准确性，因此不适于大范围的CRC早期筛查。

3.2 血液DNA 甲基化的检测

肿瘤细胞可向外周血释放 DNA，在患者血清和血浆内可以检测到异常的较高浓度的DNA甲基化[11]，因此检测肿瘤患者血液中游离的 DNA 甲基化水平可能为CRC诊断及预后等提供新的方法和思路。Epi proColon是以细胞质分裂基因9(Septin9)基因为基础开发的，也是最早商业化并进入临床试验甲基化检测试剂盒,尤其是第二代血浆 SEPI9甲基化检测试剂盒(Eoi proColon 2.0)[12]的临床应用为CRC的早期诊断提供了一重要的新手段。目前国内已有 BioChain公司授权代理第二代 SEPT9 基因甲基化CRC 检测试剂盒(Epi proColon 2．0)，并实现了国产化，初步临床试验结果显示检出CRC的总体特异性高达87.4%，敏感性为74.8%[13]。随着研究的深入，发现更多的特定基因甲基化可能作为生物标志物用于CRC早期筛选及诊断(表1)。但是血液标本不具有器官特异性，全身各部位器官的恶性肿瘤均会引起血液中甲基化指标异常，因此血液DNA甲基化检测难以作为CRC完全特异性的诊断手段。

表1 CRC患者不同类型标本中相关甲基化基因检测

3.3 粪便DNA甲基化的检测

粪便中的生物标志物检测是一种很有前途的结直肠癌筛查方法。在早期的结直肠癌中，肿瘤细胞可能脱落进入肠腔,并与粪便混合;并且肠道是碱性环境，有利于 DNA 的保存，使从粪便提取的 DNA性质稳定、敏感性高[25]。粪便样本检测作为一种检测相对高效能和高特异性的非侵入性手段，其基因甲基化检测可作为结直肠癌早期筛查工具应用于临床实践。Vimentin在CRC发生中扮演重要角色，并且很容易在粪便中检测出来，其在诊断CRC和进展期腺瘤的敏感性分别可高达81%和83%[26]，目前Vimentin基因已成为市场上首次应用粪便 DNA 甲基化作为大肠癌诊断性检测的靶基因。ColoSure是以粪便标本提取DNA样本,通过定量检测粪便中 Vimentin 基因高甲基化而开发的第一个商业化CRC筛选试剂盒[27]。但是由于粪便中混杂了多种物质，对提取高质量的粪便DNA存在一定的阻碍，因此可能出现假阴性结果，影响CRC的早期诊断。

3.4 DNA甲基化联合检测

研究表明基因甲基化联合检测优于单个基因甲基化检测，可以弥补以单一基因的甲基化检测可能存在敏感性和特异性不足的问题[28]。对CRC患者、进展期腺瘤患者和结肠镜阴性组vimentin 和SFRP2 甲基化状态检测发现，大肠癌组中 vimentin和SFRP2 甲基化阳性检出率分别为55.0%和70.0%;进展期腺瘤组中为48.0%和64.0%;正常对照组中为 6.7%和0。在病例组中两基因联合检测的敏感性为83.1%，明显高于 vimentin 的52.3%和 SFRP2 的67.7%，更要高于 FOBT的27.7%，而在正常对照组中两基因联合检测的阳性率均无明显差异[27]，提示在CRC诊断中，联合检测粪便中 vimentin 和 SFRP2 基因甲基化状态在敏感性、特异性方面均优于单个基因甲基化检测，表明基因甲基化联合检测较单基因甲基化检测更能提供较准确的诊断。

4 总结与展望

随着对肿瘤表观遗传学研究的深入，不断发现可以用作肿瘤诊断的新型生物标志物。DNA甲基化作为新的生物标志在临床上的微创诊断、预后评估、预测治疗反应、监测病情等方面不断展示其可能的潜在应用价值，为CRC筛查和早期诊断提供了不同于传统方法的全新手段，极具开发和临床应用潜力。目前已经有为数不多的几个以DNA甲基化检测为基础的商业化试剂盒投入了CRC临床诊断应用，这仅仅是该方法用于临床诊断的开端，仍然存在一些问题需要进一步解决，比如与CRC有关的标志甲基化基因的筛选，在方法上如样品储存、粪便DNA或循环DNA提取、甲基化检测标准化，以及单个基因甲基化检测与多个基因甲基化联合检测在敏感性和特异性方面的比对等，尚需进行大量细致的工作加以论证和阐明。

[1]J Ferlay，I Soerjomataram，R Dikshit,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:Sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):359.

[2]Wanqing Chen,Rongshou Zheng,Peter D.Baade,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115.

[3]Van Vugt JL，Reisinger KW，Derikx JP，et al.Improving the outcomes in oncological colorectal surgery[J].World J Gastroenterol，2014，20(35):12445．

[4]Kadiyska T,Nossikoff A.Stool DNA methylation assays in colorectal cancer screening[J].World J Gastroenterol,2015,21(35):10057.

[5]Sharma S，Kelly TK，Jones PA.Epigenetics in cancer[J]．Carcinogenesis，2010，31(1):27.

[6]Keating ST，El-Osta A．Epigenetics and Metabolism[J]．Circ Res,2015,116(4):715．

[7]Alberghini F,Petrocelli V,Rahmat M.An epigenetic view of B-cell disorders[J]．Immunol Cell Biol，2015，93(3):1．

[8]X Nan,HH Ng,CA Johnson et al.Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex[J].Nature，1998,393(6683):386.

[9]Herbst A,Kolligs FT.Detection of DNA hypermethylation in remote media of patients with colorectal cancer:new biomarkers for colorectal carcinoma[J].Tumour Biol,2012,33:297.

[10]康 倩，金 鹏，杨 浪，等.外周血游离 DNA中Septin9基因甲基化在结直肠癌筛查中的意义[J].中华医学杂志，2014，94(48):3839.

[11]Jin P，Kang Q，Wang X，et al.Performance of a second-generation methylated SEPT9 test in detecting colorectal neoplasm [J]．J Gastroenterol Hepatol,2015,305(5):830．

[12]Toth K，Sipos F，Kalmar A，et al.Detection of methylated SEPT9 in plasma is a reliable screening method for both left-and right-sided colon cancers[J].PLoS ONE，2012，7(9):e46000．

[13]赵慧霞，李秋文，董伟伟，等.粪便SEPT9基因甲基化检测在结直肠癌早期诊断中的应用研究[J]．中国临床医师杂志，2012，10(6):42．

[14]Xiao W,Zhao H,Dong W,et al.Quantitative detection of methylated NDRG4 gene as a candidate biomarker for diagnosis of colorectal cancer[J].Oncol Lett,2015,9(3):1383.

[15]Lind GE,Ahlquist T,Merok MA,et al.Identification of an epigenetic biomarker panel with high sensitivity and specificity for colorectal cancer and adenomas[J].Mol Cancer,2011,10(10):1.

[16]Hellebrekers DM,Lentjes MH,Melotte V,et al.GATA4 and GATA5 are potential tumor suppressors and biomarkers in colorectal cancer[J].Clin Cancer Res,2009,15(12):3990.

[17]Zhang X,Song YF,Wang DP,et al.Combined detection of plasma GATA5 and SFRP2 methylation is a valid noninvasive biomarker for colorectal cancer and adenomas[J].World J Gastroenterol，2015,21(9):2629.

[18]Melotte V,Lentjes MH,Niessen HE,et al.Spectrin repeat containing nuclear envelope 1 and forkhead box protein E1 are promising markers for the detection of colorectal cancer in blood[J].Cancer Prev Res,2015,8(2):157.

[19]Pedersen SK,Baker RT,Murray DH,et al.A two-gene blood test for methylated DNA sensitive for colorectal cancer[J].PloS One,2015,10(4):e0125041.

[20]Takane K,Yaqi K,Sakai A,et al.Aberrant promoter methylation of PPP1R3C and EFHD1 in plasma of colorectal cancer patients[J].Cancer Med,2014,3(5):1235.

[21]Oh T,Kim N,Moo Y,et al.Genome-wide identification and validation of a novel methylation biomarker,SDC2,for blood-based detection of colorectal cancer[J].J Mol Diaqn,2013,15(4):498.

[22]Lu H,Huang S,Zhang X,et al.DNA methylation analysis of SFRP2,GATA4/5,NDRG4 and VIM for the detection of colorectal cancer in fecal DNA[J].Oncol Lett,2014,8(4):1751.

[23]He CG,Wu HG,Deng HQ,et al.p33ING1b methylation in fecal DNA as a molecular screening tool for colorectal cancer and precancerous lesions[J].Oncol Lett,2014,7(5):1639.

[24]Zhang H,Zhu YQ,Wu YQ,et al.Detection of promoter hypermethylation of Wnt antagonist genes in fecal samples for diagnosis of early colorectal cancer[J].World J Gastroenterol,2014,20(20):6329.

[25]Imperiale TF,Ransohoff DF，Itzkowitz SH，et al．Muhitarget stool DNA testing for colorectal-cancer screening[J]．N Engl J Med,2014，370(14)：1287．

[26]Mikeska T，Bock C，Do H，et al．DNA methylation biomarkers in cancer:Progress towards clinical implementation[J]．Expert Rev Mol Diagn，2012，12(5):473．

[27]Patai AV,Valcz G,Hollosi P,et al.Comprehensive DNA Methylation Analysis Reveals a Common Ten-Gene Methylation Signature in Colorectal Adenomas and Carcinomas[J].Plos One,2015,10(8):e0133836.

[28]Young GP，Bosch LJ．Fecal tests:From blood to molecular markers[J]．Curr Colorectal Cancer Rep，2011，7(1):62．

[29]肖著军，王新颖，李丙生，等．联合检测 vimentin 和 SFRP2 甲基化在大肠癌筛查中的应用评价[J]．现代消化的介入诊疗，2014，19(1):13．

国家自然科学基金项目(81170316)

1007-4287(2016)12-2139-04

白盈盈，女，26岁，在读硕士研究生，主要从事临床实验诊断研究;朱光旭，男，副主任技师，主要从事心血管疾病发病机制及诊断研究;潘兴华，男，主任医师，主要研究方向为干细胞与组织工程。

2016-07-19)

*通讯作者