术前化疗对骨肉瘤、滑膜肉瘤中Bcl-2、P-gp表达的影响

梁铂坚，李宏伟，潘 峰，鞠海宁

(吉林大学中日联谊医院 骨科，吉林 长春130033)

术前化疗对骨肉瘤、滑膜肉瘤中Bcl-2、P-gp表达的影响

梁铂坚，李宏伟*，潘 峰，鞠海宁

(吉林大学中日联谊医院 骨科，吉林 长春130033)

骨肉瘤是恶性骨肿瘤中常见的一种，又称为成骨肉瘤，源于间叶组织，可以产生骨样组织的梭形基质细胞，好发于青少年，它约占骨原发恶性肿瘤的20%，易复发和转移，预后差[1]。滑膜肉瘤是软组织肿瘤的一种，主要发生于青壮年肢端深部的软组织，其恶性度高，而且发病率呈逐年上升趋势，是一种严重影响青壮年身心健康的恶性肿瘤[2]。近年来骨肉瘤和滑膜肉瘤仍以手术治疗为主，放化疗为辅的综合治疗手段，其在一定程度上提高了患者的生存率，很大程度上提高了患者的5年生存率[3]。但临床上仍有一定比例患者的化疗失败都是由化疗原发性或继发性耐药而导致。因而,如何使骨肉瘤及滑膜肉瘤的化疗更具有针对性、有效性,对化疗敏感性预测的研究显得至关重要。

Bcl-2是细胞凋亡的抵制基因，是目前发现的与凋亡密切相关的原癌基因之一[4]。其在癌旁组织，癌前病变组织及肿瘤组织中高表达，而在正常组织中则不表达或低表达，由此提示，Bcl-2与肿瘤的发生发展密切相关。有研究表明Bcl-2基因表达的高低可以有效预测肿瘤细胞对化疗的敏感性。并且现已有研究证实骨肉瘤的预后与Bcl-2 表达的高低密切相关，在恶性骨肿瘤复发后Bcl-2的表达明显增高[5，6]。

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)位于细胞膜上，是一种能量依赖性的结合转运蛋白，有研究发现P-gp具有抑制凋亡的作用，该发现在分子水平上为肿瘤耐药与凋亡耐受之间建立了有机的联系。研究表明P-gp通过抑制caspase-3和caspase-8两条途径的裂解激活来抑制caspase依赖型的细胞凋亡[7]。化疗是肿瘤综合治疗的重要手段,也是治疗一些肿瘤的唯一方法,但由于化疗药物本身的药物毒性,致使某些肿瘤病人在接受化疗治疗的同时而产生了严重的不良反应,给病人的生活质量造成了一定的影响。因此，探索一种既准确又简便的评价方法来预测化疗疗效,从而指导临床选择适合的化疗方案,提高化疗的疗效。本文以骨肉瘤、滑膜肉瘤为研究对象，通过检测骨肉瘤及滑膜肉瘤术前化疗和未做术前化疗标本中Bcl-2、P-gp的表达，探讨术前化疗和未做术前化疗骨肉瘤、滑膜肉瘤组织中Bcl-2、P-gp的表达及与预后的关系，为临床的肿瘤治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病例选择标准

所选病例符合以下标准:①在吉林大学中日联宜医院骨病外科经穿刺活检，病理组织学证实为骨肉瘤及滑膜肉瘤；②治疗前经胸片、CT扫描排除远处转移；③在外院未行切开活检、放疗及其他治疗；④术前均按MMIA方案化疗。该方案由甲氨蝶吟(MTX)、异环磷酰胺(IFO)、阿霉素(DOX)组成。

按上述标准选吉林大学中日联谊医院2009-2012年诊断为骨肉瘤的10例患者、滑膜肉瘤7例患者。骨肉瘤的10例患者年龄13-18岁。发病部位：股骨下端6例、胫骨上端4例、滑膜肉瘤7例患者年龄18-50岁。发病部位：股骨下端3例、前臂1例、肩关节腋下3例。治疗方式：术前化疗二疗程，休息二周后手术，术后继续化疗二疗程(未作术前化疗患者，术后直接进行化疗二疗程)，术中提取标本10%中性甲醛固定。随访结果：骨肉瘤10例患者中全部获得随访。随访期内4例作术前化疗患者未见转移及复发。6例未作术前化疗患者4例发生肺转移，2例发生复发。滑膜肉瘤7例患者5例获得随访，随访期内1例作术前化疗患者未见转移及复发，3例未作术前化疗患者发生转移及复发，1例死亡。

1.2 主要试剂

一抗为鼠抗人单克隆抗体Bcl-2及P-gp。显色用该公司生产的即用型第二代Elivision TMplus广谱试剂盒。

“是慢成说的。”大梁也扭头瞄着我，“慢成说很有可能。他说什么，橘生淮南就是橘，挪到淮北就不是橘了。东洋人带了十几年，很可能讲的东洋话。”

1.3 实验方法

严格按照北京中杉金桥生物技术有限公司生产的免疫组化试剂盒进行操作。

1.4 结果判定

Bcl-2染色阳性以细胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒为标准，P-gp染色阳性以细胞膜出现棕褐色细颗粒为标准。每张切片随选取5个高倍视野，以阳性细胞数目所占比例进行分级：<5%为阴性(-)，5%-25%为低度表达(+)，25%-50%为中度表达(++)，>50%为高度表达(+++)。低度表达以下视为阴性，中低度表达及中度表达以上表达视为阳性有意义。

1.5 统计学方法

本实验数据均采用均数±标准差表示。采用SPSS 11.0统计软件包处理，组间比较用方差分析。

2 结果

2.1 术前化疗与未作术前化疗骨肉瘤患者组织中Bcl-2与P-gp的表达

术前化疗骨肉瘤患者组织P-gp的阳性表达与未做术前化疗骨肉瘤患者组织中相比较，术前化疗骨肉瘤患者的P-gp的阳性表达明显低于未做术前化疗骨肉瘤患者，其阳性表达率分别为12.75%、45.2%(P<0.05),见表1。

2.2 术前化疗与未作术前化疗骨肉瘤患者组织中Bcl-2与P-gp表达的相关性

术前化疗和未做术前化疗的骨肉瘤患者组织中Bcl-2、Pg-p的表达均具有相关性。随着Bcl-2表达率的升高Pg-p表达也呈现显著增高趋势。

2.3 术前化疗与未作术前化疗滑膜肉瘤患者组织中Bcl-2与P-gp的表达

术前化疗滑膜肉瘤患者组织Bcl-2的阳性表达与未做术前化疗滑膜肉瘤患者组织中相比较，术前化疗滑膜肉瘤患者的Bcl-2的阳性表达明显低于未做术前化疗滑膜肉瘤患者，其阳性表达率分别为16%、67% (P<0.05),见表1。

术前化疗滑膜肉瘤患者组织Pg-p的阳性表达与未做术前化疗滑膜肉瘤患者组织中相比较，术前化疗滑膜肉瘤患者的Pg-p的阳性表达明显低于未做术前化疗滑膜肉瘤患者，其阳性表达率分别为17.7%、58.2% (P<0.05),见表1。

2.4 术前化疗与未作术前化疗滑膜肉瘤患者组织中Bcl-2与P-gp的表达的相关性

术前化疗和未做术前化疗的滑膜肉瘤患者组织中Bcl-2、P-gp的表达均具有相关性。随着Bcl-2表达率的升高P-gp表达也呈现显著增高趋势。

表1 术前化疗与术前未化疗患者肿瘤组织中Bcl-2与P-gp的表达

注：表达率为阳性细胞数所占比例；*P<0.05

3 讨论

骨肉瘤是一种好发于青壮年的恶性骨肿瘤，其原发于骨髓腔，由肿瘤性成骨细胞、骨样组织所组成，是以瘤细胞能直接形成骨样组织或骨质为特征，起源于成骨性间叶组织的最常见的原发性恶性骨肿瘤，发病突然，主要发病部位在下肢。显微镜下可见许多瘤细胞，细胞及细胞核大小，形状不一，有小型多核巨细胞，梭形细胞，不成熟的软骨细胞及恶性成骨细胞，细胞核大，染色很深。可于数月内出现肺部转移，存活率低。其恶性度高且发病率逐年上升[8-12]。

滑膜肉瘤是恶性程度较高的软组织恶性肿瘤，源于关节、滑膜及腱鞘滑膜组织，是继恶性纤维组织细胞瘤，脂肪肉瘤和横纹肌肉瘤之后的第四种最常见的肉瘤类型。发病部位以四肢的大关节为多，也可好发于前臂、大腿，腰背部的肌膜和筋膜上。是发病率较高的一种软组织肉瘤，一般原发于关节囊外，后穿入关节囊。滑膜肉瘤的发病机制目前还不清楚。主要临床症状以局部肿胀、肿块、疼痛，活动受限为主，X线以软组织肿块、肿块钙化、骨骼改变及骨膜反应为主要表现。病理分型为双相型和单相型。滑膜肉瘤即可向区域淋巴结转移。也可向远隔肺部转移[13，14]。

近年来骨肉瘤和滑膜肉瘤仍以手术治疗为主、放化疗为辅的综合治疗手段，其在一定程度上提高了患者的的5年生存率。但由于化疗药本身的药物毒性,致使某些肿瘤病人在接受化疗治疗的同时而产生了严重的不良反应。因而探索一种既准确又简便的评价方法来预测化疗疗效,以指导临床选择化疗药物和化疗方案,提高化疗疗效。近年来研究证明，肿瘤的发生和演进不仅取决于肿瘤细胞增殖和分化程度，凋亡规律失常也与肿瘤发病密切相关，进而提出一种癌基因作用的新模式，即通过抑制细胞凋亡导致肿瘤生长。肿瘤分子生物学的研究揭示细胞增殖和细胞凋亡失控是肿瘤发生发展的重要机制。目前研究也发现，细胞凋亡机制在肿瘤中的发生、发展过程中可能有重要的地位，因此，细胞凋亡抑制基因已成为分子肿瘤学研究的一个热点。

3.1 术前化疗对骨肉瘤及滑膜肉瘤患者组织中Bcl-2表达的影响

肿瘤的发生和发展不仅取决于肿瘤细胞增殖和分化程度，凋亡规律失常也与肿瘤的发病密切相关。细胞凋亡也是当今肿瘤研究的热点，其过程受到凋亡基因和抗凋亡基因的共同调节[15]。Bcl-2是细胞凋亡调控基因之一，在控制细胞凋亡的过程中Bcl-2参与抑制细胞凋亡的作用，它通过各种刺激因素广泛抑制并诱导肿瘤细胞的凋亡、从而延长肿瘤细胞的活力[16]。Bcl-2基因通过编码Bcl-2蛋白发挥抗凋亡作用，其机制为：(1)通过抗氧化剂作用或抑制氧自由基的产生而抑制细胞凋亡，而氧自由基产生分别分布在细胞的线粒体、内质网及核膜的位置，因此通过表达部位来提示肿瘤细胞的凋亡是通过抑制其调节抗氧化的途径；(2)抑制凋亡发生是通过调节细胞内Ca2+水平的分布，在细胞凋亡时，Ca2+依赖性核酸内切酶的参与DNA的消化，而Bcl-2阻断Ca2+从内质网释出，降低了依赖于Ca2+核酸内切酶的活性，从而阻断肿瘤细胞凋亡；(3)Bcl-2与Bax蛋自结合形成杂二聚体，来抑制Bax的促凋亡作用；(4)Bcl-2与ras相关蛋白交联，使ras活化，其抑制凋亡的途径是通过影响细胞的信号传导；(5)Bcl-2蛋白通过阻断内源性核酸内切酶的DNA切割活性从而阻断细胞凋亡[17-19]。vaux等[22]研究发现，把Bcl-2基因转入骨髓原始细胞使Bcl-2蛋白在细胞内高表达，导致肿瘤的发生，细胞的生存期延长，但未见明显细胞增殖率增加。由此可见，Bcl-2主要是通过调控细胞凋亡来调节细胞死亡的。Yang Q[8]等研究表明，恶性肿瘤中Bcl- 2的高表达是导致肿瘤患者的预后不良的重要原因之一，并用实验证明了Bcl- 2表达的高低与肿瘤患者预后的关系，其在骨肉瘤中的高表达是肿瘤恶性程度高的重要因素之一，并提出Bcl-2是预测化疗疗效的有效指标。

本实验结果显示：术前化疗及未做术前化疗骨肉瘤组织中Bcl-2的阳性表达率分别为10.9%和36.4%，术前化疗及未做术前化疗滑膜肉瘤组织中Bcl-2的阳性表达率分别为16%和67%，术前化疗骨肉瘤及滑膜肉瘤患者组织中Bcl-2的表达明显低于未做术前化疗患者的表达。说明术前化疗是药物通过抑制Bcl-2的表达来有效降低的肿瘤的恶性程度。通过对所有患者进行随访，证实术前化疗导致Bcl-2表达降低与预后有相关性，Bcl-2阳性表达率低的患者预后好。说明化疗后骨肉瘤及滑膜肉瘤细胞中Bcl-2的阳性表达水平是预测化疗疗效的有用指标。

3.2 术前化疗对骨肉瘤及滑膜肉瘤患者组织中P-gp表达的影响

骨肉瘤及滑膜肉瘤化疗失败的主要原因和多药耐药有着一定的关联，多药耐药是指一种药物作用于肿瘤细胞使之产生耐药性后，该肿瘤细胞逐渐对未接触过的、结构无关、作用靶点和机制不同的多种抗肿瘤药物也具有交叉耐药性。它是一种独特的广谱耐药现象[20]。P-gp可以与亲脂类化疗药物结合，依赖ATP跨膜转运作用将药物转运到细胞外，使细胞内药物浓度下降，形成P-gp介导的MDR[21]。P糖蛋白(P-gp) 是多药耐药基因(MDR)编码的蛋白质，是ATP依赖型的药物外排转运体，位于细胞膜，由1280个氨基酸组成，分子量为170×103。P-gp是一种跨膜转运糖蛋白，属于ABC膜转运蛋白超家族成员,是逆转多药耐药(MDR)的主要靶点，在多种恶性肿瘤中均呈较高表达状态[22]。有研究发现P-gp具有凋亡抑制作用，该发现在分子水平上为肿瘤耐药与凋亡耐受之间建立了有机的联系。研究表明P-gp通过抑制caspase-3和caspase-8两条途径的裂解激活来抑制caspase依赖型的细胞凋亡[2]。尽管目前有关骨肉瘤细胞及滑膜肉瘤细胞中MDR基因Pg-p表达研究尚少，但现已有研究结果提示P-gp在骨肉瘤及滑膜肉瘤中表现出内在性的高表达。在体外细胞株中已经成功建立了P-gp过度表达和多药耐药的因果关系。虽然P-gp在体内不同肿瘤中的表达和预后的相关性还有待于进一步研究，但多数学者认为骨肉瘤及滑膜肉瘤临床预后不良与P-gp的表达相关[23，24]。

本研究应用免疫组化和对比分析的方法，术前化疗及未做术前化疗骨肉瘤及滑膜肉瘤组织中P-gp的表达进行了研究，结果显示：术前化疗及未做术前化疗骨肉瘤组织中P-gp的阳性表达率分别为12.75%和45.2%，术前化疗及未做术前化疗滑膜肉瘤组织中P-gp的阳性表达率分别为17.7%和58.2%，术前化疗骨肉瘤及滑膜肉瘤患者组织中P-gp的表达明显低于未做术前化疗患者的表达。有研究发现P-gp通过多药耐药途径来抑制肿瘤细胞的凋亡，而本实验结果显示术前化疗明显降低了P-gp的表达，说明术前化疗是药物通过抑制P-gp的表达，降低了肿瘤多药耐药的发生，从而有效降低的肿瘤的恶性程度。术后对所有患者进行随访，证实术前化疗导致P-gp表达降低与预后有相关性，P-gp阳性表达率低的患者预后好。说明化疗后骨肉瘤及滑膜肉瘤细胞中P-gp的阳性表达水平是预测化疗疗效的有用指标。

综上所述，本文得出如下结论:术前化疗可以有效降低肿瘤的恶性程度。通过本实验可以说明：术前化疗导致Bcl-2、P-gp表达的降低与肿瘤的预后有相关性，进行术前化疗的患者Bcl-2、P-gp阳性表达率低，其预后好。而同一患者Bcl-2、P-gp表达具有相关性，说明化疗后骨肉瘤及滑膜肉瘤中Bcl-2、P-gp的阳性表达水平是预测化疗疗效的有用指标。

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吉林省科技发展计划项目(200705307)

1007-4287(2016)12-2102-04

2016-02-27)

*通讯作者