头孢吡肟敏感性低于头孢他啶阴沟肠杆菌的耐药基因研究

余建洪，曾章锐，刘 恋，张开炯，李宝林，刘靳波

(西南医科大学附属医院 检验科，四川 泸州646000)

头孢吡肟敏感性低于头孢他啶阴沟肠杆菌的耐药基因研究

余建洪，曾章锐，刘 恋，张开炯，李宝林，刘靳波*

(西南医科大学附属医院 检验科，四川 泸州646000)

目的 研究临床分离的阴沟肠杆菌对头孢吡肟(FEP)敏感性低于头孢他啶(CAZ)的耐药基因，为医院感染控制提供参考。方法 收集临床分离的经琼脂稀释法证实的头孢吡肟(PEP)敏感性低于CAZ的阴沟肠杆菌菌株8株，采用聚合酶链反应(PCR)扩增细菌耐药基因。耐药基因水平传播采用质粒接合试验。结果 8株菌株中有3株耐药基因OXA-1和OXA-31同时阳性，2株耐药基因OXA-10和OXA-35同时阳性，且以上基因在菌株质粒中均扩增阳性，但仅2株接合成功，而耐药基因PSE-1全部阴性。结论 耐药基因OXA1、OXA10、OXA31和OXA35是导致阴沟肠杆菌对头孢吡肟敏感性低于头孢他啶的重要机制之一，有通过质粒介导进行传播的风险，应采取措施防止其爆发流行。

阴沟肠杆菌；头孢吡肟；头孢他啶；耐药机制；聚合酶链反应

(ChinJLabDiagn,2016,20:2058)

阴沟肠杆菌是存在于人和动物肠道内的正常菌群，为条件致病菌。由于广谱抗菌药物的大量使用以及患者免疫功能低下等原因，阴沟肠杆菌已成为医院感染中非常重要的病原菌之一[1]。由于头孢吡肟的大量使用，临床分离出头孢吡肟敏感性低于头孢他啶的铜绿假单胞菌[2,3]，且与OXA-1、OXA-10、OXA-31、OXA-35或PSE-1等耐药基因有关[4]。本文对阴沟肠杆菌头孢吡肟敏感性低于头孢他啶的的相关耐药基因进行研究。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2013年9月—2015年9月经MicroScan WalkAway 96Plus全自动微生物鉴定/药敏测试系统检测和琼脂稀释法证实的FEP的MIC高于CAZ的MIC的8株阴沟肠杆菌，剔除同一患者相同部位重复菌株。试验操作及菌株MIC判断参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)(2015版)标准。质控菌株为大肠埃希菌(ATCC 25922)及铜绿假单胞菌(ATCC 27853)。利福平耐药的大肠埃希菌EC600为接合试验用。

1.2 试剂与材料 FEP和CAZ干粉为中美上海施贵宝制药有限公司产品，MH琼脂干粉为杭州天和产品，LB培养基为Oxoid公司产品，质粒提取试剂盒为百泰克公司产品，PCR引物、Buffer、dNTPs、Taq DNA酶和MgCL2为TaKaRa公司产品，DNA Marker DL2000为大连宝生公司产品，琼脂糖为Oxoid公司产品。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 细菌总DNA耐药基因扩增 煮沸法提取细菌总DNA作为模板，通过降落PCR扩增耐药基因OXA-1、OXA-10、OXA-31、OXA-35和PSE-1，引物见表1。反应体系( 50 μl)：TaKaRa Ex Taq(5 U/μl)0.25 μl， 10×Ex Taq Buffer(Mg2+free)5 μl，MgCl2(25 mM)4 μl，dNTP Mixture(各2.5 mM)4 μl，模板2 μl，上游引物(10 μM)1 μl，下游引物(10 μl)1 μl，加0.1%RNA酶的灭菌蒸馏水至50 μl。反应参数[5]，见图1。反应结束后取6 μl产物在15 g/L琼脂糖中进行电泳分析。

表1 本研究所用的PCR引物

图1 本研究所用PCR反应参数

1.4 耐药酶基因水平传播分析

1.4.1 质粒耐药基因 根据质粒提取试剂盒说明书，对耐药基因阳性菌株提取质粒DNA作为反应模板，对相应的耐药基因进行PCR扩增。

1.4.2 接合试验 对质粒DNA耐药基因扩增阳性菌株进行接合试验。方法同文献报道[6]。

2 结果

2.1 细菌总DNA耐药基因扩增结果

8株菌株中有3株(2、4、7号菌株)耐药基因OXA-1和OXA-31同时阳性，2株(5号、8号菌株)耐药基因OXA-10、OXA-35同时阳性，耐药基因PSE-1全部阴性。扩增产物电泳图见图2-5。

图2 OXA-1扩增产物电泳图 图3 OXA-31扩增产物电泳图

图4 OXA-10基因扩增电泳图 图5 OXA-35基因扩增电泳图

备注：图2-5中1-8分别为1-8号菌株，N为阴性对照，M为DNA Marker(DL2000)

2.2 质粒DNA耐药基因扩增结果

细菌总DNA耐药基因阳性菌株的质粒DNA相应基因扩增均为阳性，即2号、4号、7号菌株质粒DNA耐药基因OXA-1和OXA-31同时阳性，而5号、8号菌株质粒DNA耐药基因OXA-10和OXA-35同时阳性。扩增产物电泳图见图6。

图6 细菌质粒DNA耐药基因扩增电泳图

备注：1-3分别为2号、4号、7号菌株blaOXA-1，4、5分别为5号、8号菌株blaOXA-10，6-8为分别为2号、4号、7号菌株blaOXA-31，9、10分别为5号、8号菌株blaOXA-35，N为阴性对照，M为DNA Maker(DL2000)

2.3 接合试验

2号和5号菌株质粒接合试验成功，经MicroScan WalkAway 96 Plus全自动微生物鉴定/药敏测试系统鉴定为大肠埃希菌，分别扩增出OXA-1、OA-31和OXA-10、OXA-35。

3 讨论

肠杆菌科细菌是医院获得性感染的重要细菌之一，占所有分离菌株的45.3%，而肠杆菌属临床分离率在肠杆菌科细菌中排名第三位，仅次于大肠埃希菌和克雷伯菌属[7]。而阴沟肠杆菌是肠杆菌属的典型代表，随着第4代头孢菌素的使用，头孢吡肟耐药率逐年增加，敏感性明显下降[8，9]。阴沟肠杆菌的耐药机制主要有耐药酶的产生、外排系统的过度表达以及质粒携带多药耐药整合子基因[10-12]。

本文对8株头孢吡肟敏感性低于头孢他啶阴沟肠杆菌的耐药基因OXA-1、OXA-10、OXA-31、OXA-35和PSE-1进行扩增，结果显示：有5株扩增阳性，其中2号、4号和7号菌株耐药基因OXA-11和OXA-31同时阳性，与文献[13]报道一致，OXA-1基因的表达能使阴沟肠杆菌头孢吡肟或头孢匹罗的MIC升高，而对头孢他啶没有影响，尤其是当孔蛋白OMP钝化或表达降低时，这种效应更明显。其机制[14]可能为OXA-1能选择性地水解一些具有2-氨基-5噻唑基结构的头孢菌素类，如头孢吡肟、头孢匹罗，而对其他类型的头孢菌素没有水解作用，如头孢他啶。并且耐药基因OXA-1和OXA-31对以上特殊耐药表型的影响具有协同作用[15]。而5号和8号菌株耐药基因OXA-10和OXA-35同时阳性，原因[16]可能为OXA-35是一种OXA-10相关的β内酰胺酶，两者均可以使头孢吡肟敏感性降低，而对头孢他啶无明显影响。由于具有以上特殊耐药表型的菌株数量较少，PSE-1扩增结果全部为阴性。5株耐药基因阳性菌株质粒DNA相应基因全为阳性，其中有2株接合成功，可能与菌株携带耐药基因的整合子有关[17]。

头孢吡肟敏感性低于头孢他啶的阴沟肠杆菌耐药基因可通过质粒介导传播，应引起临床医师和感染控制人员的高度警惕，应采取措施防止其爆发流行。

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Study resistant genes of less susceptibility to cefepime than to ceftazidime in clinical isolates of Enterobacter cloacae

YUJian-hong,ZENGZhang-rui,LIULian，etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective Study resistant genes of less susceptibility to cefepime(FEP) than to ceftazidme(CAZ) in clinical isolates of Enterobacter cloacae,so as to provide references for controlling the hospital infection.Methods A total of eight isolates of Enterobacter cloacae which had been confirmed being less susceptible to FEP than to CAZ for minimal inhibitory concentration(MIC) by agar dilution method were collected.The resistance genes were amplified by polymerase chain reaction(PCR).Horizontal transmission of the resistance genes were tested by Plasmid conjugation test.Results The resistance gene amplification results showed:OXA-1 and OXA-31 were positive in three strain simultaneously,OXA-10 and OXA-35 were positive in two strain Simultaneously,but PSE-1 was not amplified in all eight isolates.The resistance genes in plasmid DNA of five all positive genomic strains were amplified ,but only two of the five strains were successfully joined.Conclusion The resistance gene of OXA-1,OXA-10,OXA-31 or OXA-35 was an important mechanism,that resulted in Enterobacter cloacae less suscepitibiltiy to PEF than to CAZ,and has transmission risk mediated by plasmid.Measures should be taken to prevent the outbreak.

Enterobacter cloacae;Cefepime;Ceftazidme;Resistance mechanism;Polymerase chain reaction

四川大学与泸州市人民政府战略合作项目，2013CDLZ-S15

1007-4287(2016)12-2058-04

R378.2

A

余建洪，男，主管检验师、临床执业医师，医学硕士，研究方向：临床检验诊断学。

2016-04-28)

*通讯作者