云南337名非综合征型聋患者GJB3基因C538T和G547A突变分析

李彦琼,刘德胜,吕超绍,李 丽,郑永钦,左荣霞,撒亚莲*

(1.昆明理工大学附属医院(云南省第一人民医院)临床基础医学研究所，云南省出生缺陷与遗传病研究重点实验室，云南 昆明650032；2.四川省中医院 急诊科，四川 成都610075)

云南337名非综合征型聋患者GJB3基因C538T和G547A突变分析

李彦琼1,刘德胜2,吕超绍1,李 丽1,郑永钦1,左荣霞1,撒亚莲1*

(1.昆明理工大学附属医院(云南省第一人民医院)临床基础医学研究所，云南省出生缺陷与遗传病研究重点实验室，云南 昆明650032；2.四川省中医院 急诊科，四川 成都610075)

目的 探讨云南省部分特教学校聋生携带GJB3基因C538T和G547A的突变率。方法 采集337名非综合征型耳聋学生及150名健康人群的外周静脉血，提取基因组DNA，PCR扩增含GJB3基因C538T和G547A的基因片段，扩增产物经直接测序进行基因突变位点的检测及鉴定。结果 在337名耳聋学生和150名健康人群中未检测到GJB3基因C538T和G547A的突变。结论 GJB3基因C538T和G547A可能不是该地区非综合征型耳聋患者的突变热点，为进一步开展耳聋基因的筛查研究提供重要信息。

聋；GJB3基因；DNA；突变；测序

(ChinJLabDiagn,2016,20:2024)

耳聋(deafness)又名听觉障碍(hearing impairment)或听力丧失(hearing lossing)，是常见的感觉系统疾病之一。根据表型特点不同(是否伴随其它疾病)，分为综合征型耳聋和非综合征型耳聋。已有研究表明，约50-60%的耳聋患者有分子病因，为遗传性聋，其中约80%的遗传性聋患者为非综合征型聋[1,2]。GJB3 (encoding connexin 31,Cx-31)基因突变可以引起常染色体显性或者隐性非综合征型耳聋。GJB3是夏家辉院士在世界上首次报道的耳聋相关基因，是我国克隆、定位疾病基因零的突破[3]。当前，北京解放军总医院等多个临床和研究团队在我国多个地区开展了耳聋患者GJB3基因突变的研究[4-6]，其中GJB3基因C538T和G547A位点被认为是致病突变，但其在云南地区非综合征型耳聋人群中的携带率并不清楚。本研究以云南省部分特殊教育学校聋生为研究对象，通过PCR产物直接测序法来检测337名聋生携带GJB3基因C538T和G547A突变的频率，希望为明确该地区非综合征型耳聋的分子病因、为开展耳聋基因临床筛查及丰富中国人群致聋基因的突变类型和突变频率提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 研究对象

实验组为德宏州特教学校、腾冲特教学校、保山特教学校、丽江特教学校、普洱特教学校等职业学校的耳聋学生，对照组为听力正常的人群。实验组337名，包括男181例，女156例，平均年龄为14.31岁；对照组为150名，男79例，女71例，平均年龄为16.73岁.在知情同意后，采集1-2 ml外周静脉血(EDTA抗凝)。

1.2 主要仪器设备和试剂

离心机(Hitachi,CR22G)；PCR仪(Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler)；电泳槽和电泳仪(BG-Power 600i)；凝胶电泳成像分析系统(Bio-Rad ChemiDoc XRS)；低温冰箱(RECVO公司，572L型)；电热恒温三用水箱(北京市永光明医疗仪器厂，HH-W21 600型)；测序仪为ABI 3730XL。全血DNA提取试剂盒和电泳所需试剂购自北京百泰克生物技术有限公司；PCR扩增试剂(2x Taq PCR MasterMix)购自北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA的提取 依照试剂盒说明书逐步抽提DNA，取1 μl用于琼脂糖凝胶电泳检测，其余保存于-80℃冰箱备用。

1.3.2 引物设计与合成[7]从Genebank下载GJB3基因序列(NT_004511)，采用GeneTool软件设计引物，上游引物为F:5-TACGATGGTTTTTCCTCTAATTCT-3’；下游引物为5-TTGCATAACTTAGTGAACTCAGAG -3，扩增片段为986 bp。

1.3.3 GJB3 DNA基因片段的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) PCR扩增体系为20 μl，含2 xTaq PCR MasterMix 10 μl，25 μmol/L上游、下游引物各0.25 μl，模板DNA 1 μl,扩增条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，53℃退火45 s,72℃延伸60 s,32个循环；72 ℃充分延伸7 min，4℃保存。

1.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 取1 μl PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.3.5 PCR产物直接测序 测序引物与PCR扩增引物相同,对PCR产物用酒精沉淀法纯化，经Bigdye测序反应，用ABI 3730XL测序仪进行测序.测序结果采用Genetool软件分析。

2 结果

2.1 GJB3 DNA基因片段的PCR扩增产物

对337名耳聋学生和150例健康人的外周血DNA样本进行PCR扩增，均扩增到特异性条带986 bp，其片段大小与预期结果相符合(见图1)。

图1 含GJB3基因C538T和G547A位点的PCR扩增产物

2.2 GJB3 DNA基因片段扩增产物的测序分析

将全部样本的PCR扩增产物直接测序，将其与GJB3基因的标准序列(NG_008309.1；GI:194595505)比对，在耳聋组和对照组中的所有个体均未检测到GJB3基因C538T和G547A位点的突变。

3 讨论

GJB3基因定位于染色体1p33-p35，全长3617 bp，编码有270个氨基酸的缝隙连接蛋白Cx31[8]。缝隙连接(gap junction)又称为通讯连接(communication junction)，见于相邻两细胞的胞膜中，其形态为许多间隔大致相等、彼此相接的连接点，中间有直径约2 nm的管腔，使细胞间可以直接交换某些小分子物质和离子，借以传递化学信号和电冲动[9]。内耳的缝隙连接在维持内淋巴液K+离子浓度、正常听觉系统的功能中扮演重要角色[10]。

GJB3基因在DNA水平的突变可能导致转录后翻译出的蛋白质结构、功能的异常。据夏家辉院士等报道，在1个湖南耳聋家系中检测到GJB3基因编码区C538T突变，使其参与编码的第180位氨基酸出现终止突变；其次，在1个浙江耳聋家系中检测到GJB3基因编码区G547A突变，使183位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸；另外，该研究团队对GJB3基因C538T和G547A突变的功能、机制研究的结果表明，GJB3基因突变与耳聋表型相关，是致聋的分子病因[3]。李庆中等对130例非综合征型遗传性耳聋患者检测GJB3基因编码区的单核苷酸多态性，仅有1名患者携带GJB3基因G547A杂合突变，未检测到C538T位点的突变[6]。陈垲钿等在200名非综合征型聋患者中没有检测到GJB3基因C538T和G547A突变[11]。Mhatre等用PCR产物测序法、高效液相检测63个非综合征型耳聋患者携带的GJB3基因多态性位点，未检测到GJB3基因C538T和G547A突变[12]。马静等在昆明市儿童医院门诊收集到的118例极重度非综合征型感音神经性耳聋患儿外周血样本，抽提DNA后用飞行质谱技术检测GJB3基因C538T和G547A突变，在所有个体中均未发现该2个位点的突变[13]。上述研究结果与我们用PCR产物直接测序法检测云南部分地区特教学校的337名非综合征性耳聋患者的结果基本一致。提示GJB3基因C538T和G547A可能不是云南地区散发的非综合征性耳聋患者的突变热点。

综上所述，GJB3基因C538T和G547A突变在散发性非综合征型耳聋患者中携带率较低，其可能是部分耳聋家系的分子病因。已有的研究表明，致聋基因数目庞大，而我们当今认识到的仅是有限的一部分，对于分子病因尚不清楚的患者可能存在其它基因、其它位点的突变[14]。由此可见，对遗传性耳聋患者分子病因的探讨及其临床转化应用还有很远的路要走。

致谢：感谢德宏州特教学校、怒江特教学校、普洱特教学校等所有教职员工和学生在本课题研究中给予的支持和帮助。

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Mutation analysis of GJB3 538T and G547A in deafness students from Yunnan special educational schools

LIYan-qiong,LIUDe-sheng,LÜChao-shao,etal.

(InstituteofClinicalandBasicMedicalSciences,TheAffiliatedHospitalofKunmingUniversityofScienceandTechnology(YunnanProvincialFirstPeople’sHospital),YunnanProvincialKeyLaboratoryforBirthDefectsandGeneticDiseases,Kunming650032，China)

Objective Objective To explore the gene mutations of GJB3 C538T and G547A in Yunnan special educational schools with non-syndromic hearing impairment students.Methods Genomic DNA was isolated from peripheral blood of 337 students with hearing impairment and 150 healthy controls.The polymerase chain reaction (PCR) was performed with one pair of primer in the subjec’s DNA fragments of GJB3,and subsequently its products was analyzed by direct sequencing to identify mutations spots including GJB3 C538T and G547A.Results There were no mutation of GJB3 C538T and G547A in deafness students with non-syndromic hearing impairment as well as in the control group.Conclusion It may imply that GJB3 C538T and G547A were not mutation spots in the area of Yunnan province.The results provide important information for development gene screening in the deafness patients.

Deafness;GJB3 gene;DNA;mutation;sequencing

国家自然科学基金资助项目(31060155)，云南省科技厅-昆明医科大学联合专项应用基础研究项目(2014FB092)

1007-4287(2016)12-2024-03

R764.43

A

2016-08-10)

*通讯作者