绿茶提取物对乳腺癌细胞株MCF-7的作用机制探讨

冯 强,李 毅,王文洋,夏鹏程,杨宪勇,张元湖

(1.泰安市中心医院 检验科，山东 泰安271000;2.山东农业大学生命科学院)

*通讯作者

绿茶提取物对乳腺癌细胞株MCF-7的作用机制探讨

冯 强1.2,李 毅1,王文洋1,夏鹏程1,杨宪勇1,张元湖2*

(1.泰安市中心医院 检验科，山东 泰安271000;2.山东农业大学生命科学院)

目的 研究绿茶提取物的抗肿瘤活性。方法 不同浓度的绿茶提取物作用于MCF-7细胞，通过观察细胞形态，检测细胞周期和凋亡。结果 绿茶提取物可以阻滞人乳腺癌细胞株MCF-7生长周期于G1 期；荧光染色显示细胞凋亡率增高，电镜观察，出现细胞染色质浓缩、核周边集，线粒体形态正常等细胞凋亡的典型特征；绿茶提取物作用后可以导致MCF-7细胞中Caspase3蛋白活性增强，促进肿瘤细胞的凋亡。结论 绿茶提取物对乳腺癌细胞均有一定的抑制作用，进一步筛选其有效成分可以用于肿瘤的预防与治疗。

绿茶提取物；MCF-7；细胞凋亡；乳腺癌；抗肿瘤

(ChinJLabDiagn,2016,20:1999)

乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。在我国部分大城市，乳腺癌已居女性恶性肿瘤的首位[1]。有文献表明，亚洲妇女罹患乳腺癌的风险低于欧洲和美国妇女[2]，近年来多种研究证实，茶叶不仅能够降脂、减肥、降压、抗辐射之外，还含有抗病毒、抗肿瘤等天然有效成分，可抑制肿瘤细胞发生、发展[3]。但是绿茶提取物是否能真正有抑制肿瘤作用，尤其是对乳腺癌的抑制作用及其原理尚未明确。本研究希望通过探讨绿茶提取物对乳腺癌细胞株MCF-7的诱导凋亡的作用机制，以期为寻找新的抗肿瘤天然药物提供新的思路和途径。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌细胞株MCF-7由本实验室保存。Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒、细胞周期试剂盒、TUNEL试剂盒购于Becton Dickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 倒置显微镜镜及透射电镜观察细胞形态变化 用绿茶提取物浓度为20、40、60 μg/ml处理细胞，RPMI1640 作为空白对照，细胞处理48 h 后，固定后醋酸双氧铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察。

1.2.2 MCF-7细胞周期和凋亡的检测 配制浓度为1×106个/ml 的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞悬液，分别加入20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、100 μg/ml 绿茶提取物溶液，于24 h、48 h、72 h各时间点取每组细胞进行MTT法检测细胞凋亡率。同时，流式细胞仪上样检测，利用分析软件CellQuest 计算细胞凋亡率；TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况。

1.2.3 Caspase-3蛋白检测 采用链酶亲合素生物素复合物 ( SABC )法加微波修复，按照说明书操作。

1.3 统计学处理

所有数据均采用SPSS13.0软件完成。各处理组均数与对照组比较用LSD-t检验.结果以mean±SD表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绿茶提取物对MCF-7细胞形态的影响

倒置显微镜下，对照组细胞生长状况良好，透明度大,折光性强,细胞形态呈多边形且连成片；随着加入的绿茶提取物浓度的增加，细胞形逐渐出现皱缩，变圆，折光性变弱，细胞数目逐渐减少。

电镜下，对照组MCF-7细胞的细胞核形状不规则，核内染色质分布均匀，核仁明显，胞质内核糖体丰富，线粒体外膜和内嵴完整。随着绿茶提取物浓度的增加，细胞胞质内的线粒体损伤越来越严重，部分呈现空泡样和髓鞘样变。浓度达到60 μg/ml时，细胞核染色质浓缩，凝集呈半月形或团块状，聚集在核膜内缘，胞质内出现许多大小不等的空泡和自噬体，细胞外可查见大量细胞碎片。(图1)

图1 绿茶提取物对MCF-7细胞形态和结构的影响

2.2 绿茶提取物对MCF-7细胞凋亡的影响

MTT检测结果显示，绿茶提取物对 MCF-7人乳腺癌细胞的抑制效果随浓度升高而增加。100 μg/ml浓度处理 MCF-7人乳腺癌细胞时，抑制率高达53.47%。在24 h、48 h、72 h时，同一浓度的绿茶提取物抑制率逐渐升高，表明同一浓度的绿茶提取物的抑制率具有时间依赖性。(图2-A)

应用AnnexinV-FITC/PI双染法检测绿茶提取物对MCF-7的凋亡率。对照组在24h凋亡率为57.8±0.52，实验组凋亡率为77.73±0.96，两组间凋亡率差异有显著统计学意义(P<0.01)。不同浓度绿茶提取物作用于乳腺癌细胞48 h后，差异也具有统计学意义(P<0.05)。(图2-B)

TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况，通过荧光显微镜进行检测，通过观察发现，经过绿茶提取物作用后的荧光明显增强。流式细胞仪检测绿茶提取物作用于人乳腺癌细胞株MCF-7 48 h 后， 40、60 μg/ml组 G1期及S期二倍体 DNA 含量变化显著(P<0.05)，且各浓度组间比较差异也具有统计学意义(P<0.05)。细胞周期出现 G1 期阻滞现象，S期细胞相应减少，亚G1峰呈递增态势。提示绿茶提取物可使细胞周期阻滞于G1 期。(图2-C)

2.3 绿茶提取物对对MCF-7细胞中Caspase-3活性的影响

通过图3可以看出，绿茶提取物作用MCF-7细胞后，随着绿茶提取物浓度的提高，Caspase-3活力逐渐升高，具有剂量依赖性；并且同一浓度的绿茶提取物组的Caspase-3活力随时间的延长而升高，具有时间依赖性。(图3)

3 讨论

茶叶是亚洲人最喜欢，也是最普遍饮用饮料。目前，大量研究表明，绿茶提取物具有抗氧化、防癌、抗肿瘤、抗辐射、抗病毒、增强机体抵抗力、降血糖和血脂、预防心血管疾病、抗衰老抑菌、除臭等多种功能[4]。

对肿瘤细胞周期的阻滞作用和诱导肿瘤细胞凋亡是绿茶提取物抑制肿瘤细胞生长的重要机理。细胞调控机制的紊乱，细胞失控性增长,其结果导致肿瘤的发生。表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)可以通过影响肿瘤细胞生长周期正常进程而抑制肿瘤细胞的生长,可使肿瘤细胞停留在某一期"当癌细胞生长阻滞在G0期,达到某一程度和时间仍不能被解除使细胞无法进入S期和M/G2时，将激活细胞内的某机制启动程序,导致细胞无法正常分化而死亡[5，6]。EGCG抑制癌细胞生长,从而达到防癌抗癌的目的。细胞凋亡是在特定时空中发生的受机体严格调控的程序化细胞死亡过程。细胞凋亡被认为是一种正常的生物学老化现象。目前大多数化疗药物都是通过诱导细胞凋亡达到清除肿瘤细胞的作用。绿茶提取物抗肿瘤作用诱导人肝癌细胞、表皮癌细胞、鼻咽癌细胞、胃癌细胞、大肠癌细胞、前列腺癌细胞等肿瘤细胞凋亡已经有很多人在研究[7]。我们的研究也证实绿茶提取物可以把瘤细胞周期的阻滞在G0/G1期，细胞增殖出现严重阻滞。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能[8,9]。Caspase-3正常以酶原(32 KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17 KD)和两个小亚基(12 KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

图2 绿茶提取物对细胞凋亡的影响

图3 绿茶提取物对MCF-7细胞中Caspase-3活性的影响

目前，食品中的各种生物活性物质在癌症形成的各个阶段均有特定的保护作用。饮食与癌症发生的众多途径有关，包括细胞凋亡、细胞周期的控制与分化、血管生成、DNA 修复以及致癌物质的代谢[10]。对于绿茶提取物，在抗癌、防癌方面具有诸多功效，绿茶作为天然植物，其机理的最终探明，将为茶叶及其组分药用价值的开发和临床应用，并最终造福人类。

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Research of The mechanism on Green Tea Extracts to Breast Cancer Cell Line MCF-7

FENGQiang,LIYi,WANGWen-xiang，etal.

(TheCentralHospitalofTaian,Taian271000,China)

Objective Green tea extracts have many effects on anti-cancer,but the corresponding mechanism is still exploring.Methods In this experiment,different concentrations of green tea extracts were applied onto MCF-7 cells.Results Typical characteristics of cell apoptosis,such as chromatin condensation,perinuclear clustering and mitochondria morphism,were observed in SEM pictures.The flow cytometry detected that green tea extracts can facilitate MCF-7 apoptosis and could retard MCF-7 growth at G1 stage.Fluorescence staining reflects that green tea extracts increases apoptosis rate.Conclusion Therefore,green tea extracts can be used as similar demethylated,low-toxicity and even nontoxic natural plant drugs for antineoplastic.

green tea extracts;MCF-7;apoptosis;breast cancer;anticarcinoma

1007-4287(2016)12-1999-04

R737.9

A

2016-03-27)