肺炎支原体双向电泳条件的探索

胡 璇，苑 鑫*，柏长青*,牛文凯，袁 静，冯羽中，李璞媛，刘慧莹

(1.军事医学科学院附属医院 呼吸与危重症医学科，北京100071；2.军事医学科学院疾病预防控制所，北京100071)

肺炎支原体双向电泳条件的探索

胡 璇1，苑 鑫1*，柏长青1*,牛文凯1，袁 静2，冯羽中1，李璞媛1，刘慧莹1

(1.军事医学科学院附属医院 呼吸与危重症医学科，北京100071；2.军事医学科学院疾病预防控制所，北京100071)

目的 建立适用于肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae,MP)的双向电泳技术。方法 对双向电泳实验中的三个关键因素：全蛋白提取量、固相PH梯度胶条范围、蛋白上样量进行摸索，比较和分析标准株FH电泳图谱，利用液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)鉴定部分蛋白斑点。结果 采用菌液离心结合超声破碎的方法提取全蛋白，上样量为2 mg，固相PH梯度胶条选取PH4-7，可以得到蛋白点分布均匀的双向电泳图谱，蛋白点数为60±2。利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术成功获得了分子伴侣蛋白(Chaperone protein DnaK)，鉴定成功率为100%。结论 成功建立了适用于肺炎支原体蛋白质组分析的双向电泳技术条件，为肺炎支原体蛋白质组学的研究提供一个可靠的技术平台。

肺炎支原体；蛋白质组学；双向电泳技术

(ChinJLabDiagn,2016,20:2006)

肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)是呼吸系统感染的主要致病菌之一，是我国成人社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)的首要致病菌[1-3]。MP中约有22个功能蛋白尚未明确[4]，这些蛋白在MP的致病性或耐药性等方面的作用需进一步探讨。双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis of protein,2-DE)可以为MP蛋白质组学研究提供进一步的分析工具。由于肺炎支原体具有临床分离培养困难、培养周期长、培养条件严格的特点，目前国内外对肺炎支原体蛋白质双向电泳方面的研究较少。

为了建立稳定的适用于肺炎支原体的双向电泳技术，我们针对2-DE中3个关键环节：蛋白提取方法、上样量和固相PH胶条范围进行了实验探索。通过多种条件的比较筛选，优化出一套适用于肺炎支原体的双向电泳技术，可以为以后研究肺炎支原体蛋白质组学提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本及仪器

1.1.1 样本来源

肺炎支原体标准菌株FH(ATCC15531)购自美国。

1.1.2 试剂

CMO4O3购自OXOID公司；IPG胶条(18 cm，PH4-7，PH3-10)，丙酮均购自GE Healthcare公司；丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，十二烷基磺酸钠(SDS)，四甲基乙二胺(TEMED)，过硫酸铵，碘代乙酰胺，二硫苏糖醇(DTT)，1.5M TRIS均购自AMRESCO公司；其余均为国产分析纯试剂。

1.1.3 仪器

Protein Ⅰ水平电泳仪，Protein Ⅱ垂直电泳仪及附件购自Bio-Rad公司；GE Image scanner Ⅲ扫描仪购自GE Healthcare公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养

将标准株FH接种到400ml液体培养基中，37℃培养3-5天。根据颜色改变单位试验(color change unit,CCU)检测结果，明确待测菌株浓度达到104[5]。

1.2.2 蛋白质样品制备[6，7]

采用离心粗提取法和离心结合超声破碎法两种方法制备蛋白样品。

离心粗提取法：400 ml菌液4℃，10 000 g，30 min离心，弃上清收集菌体。沉淀用0.5×PBS洗3遍，收集沉淀。沉淀中加入裂解液(8M 尿素，50 mM DTT,4% CHAPS)。加入45 μl RNaseA和45 μl RNase。室温静置1 h，离心后收集上清。用GE Healthcare公司2-D Quant Kit 试剂盒定量，2 mg/支分装后-80℃冻存。

离心结合超声破碎法：400 ml菌液4℃，10 000 g，30 min离心，弃上清收集菌体。沉淀用0.5×PBS洗3遍，收集沉淀。沉淀中加入裂解液(8M 尿素，50 mM DTT，4% CHAPS)，超声破碎5 min。加入45 μl RNaseA和45 μl RNase。室温静置1 h，离心后收集上清。用GE Healthcare公司2-D Quant Kit 试剂盒定量，2 mg/支分装后-80℃冻存。

1.2.3 等电聚焦电泳(isoelectronic focusing,IEF)

分别取1 mg、2 mg蛋白样品量进行一向电泳上样量的优化，样品中加入1 ml预冷的丙酮，过夜后，4℃，13 000 g，离心30 min，加入348 μl 8M水化液(裂解液中加入微量溴酚蓝),1.7 μl IPG buffer混匀后，室温静置1 h，15℃，23 000 g，离心40 min。取上清上一向电泳。一向电泳的固相PH胶条范围选取两个范围进行优化：PH4-7、PH3-10。电泳参数如表1。

1.2.4 第二向-垂直平板SDS-PAGE

一向胶条先用DTT平衡胶条15 min，再用碘代乙酰胺平衡胶条15 min，将平衡后的 IPG 胶条移至凝胶的上方。进行二向电泳，20 mA先进行20 min，再换90 mA进行3 h。二向电泳后凝胶用染色液(考马斯亮蓝G-250)染色过夜，再用1%冰乙酸脱色。

表1 一向电泳参数

1.2.5 图像扫描与分析

凝胶用GE Image scanner Ⅲ扫描仪扫描，并对图像进行分析。

1.2.6 蛋白斑点胶内酶解和质谱分析

切取凝胶中的蛋白斑点，送至华大蛋白质研发中心有限公司分析，进行胶内酶解和质谱分析，获得蛋白斑点的肽质量指纹图谱 (peptide mass fingerprinting,PMF),进行数据库搜索比对，初步对蛋白点进行鉴定。

2 结果

2.1 双向电泳条件优化

对双向电泳中三个关键环节进行优化：①两种方法提取的全蛋白；②不同的蛋白上样量；③不同的固相pH胶条范围。共获得8幅双向电泳图，通过比较分析选取离心结合超声破碎的方法提取全菌蛋白，采用2 mg的蛋白上样量，在pH值4-7范围内进行双向电泳，可以得到蛋白点分布均匀的双向电泳图谱，蛋白点数为 60±2(见表2)。

2.2 鉴定蛋白

选取最优的双向电泳图中3个蛋白质点进行质谱鉴定。质谱分析后，获得3个蛋白质点的肽质量指纹图谱，鉴定成功率为100%。蛋白鉴定结果见表3。

3 讨论

蛋白质是基因功能的最终执行者，双向电泳从等电点和分子量两个方面展示蛋白质，是蛋白质组研究中的经典方法。MP的双向电泳条件尚无标准成熟方案，需要对双向中三个关键环节进行试验探索。双向电泳中最关键的环节是蛋白样品的制备，蛋白裂解的不充分会影响蛋白量的多少，通过摸索对MP提取全蛋白采用的裂解液体系为：8M尿素，50 mM DTT,4%CHAPS，结合超声破碎5 min，试剂盒定量结果为50 μl/mg；蛋白质的上样量一般为100 μg-2 mg[6，8，9]，根据胶条长度的不同而选择不同的蛋白上样量，实验发现2 mg蛋白上样量比1 mg蛋白上样量得到的蛋白电泳图更清晰；双向电泳中先根据蛋白等电点的不同进行一向分离，再根据蛋白分子量的不同进行二向分离，实验发现一向分离选取PH值3-10范围的胶图比PH值4-7范围的胶图分辨率差，也不利于后续取点鉴定，选择PH值为4-7范围进行一向电泳可以得到清晰的电泳图，取点后进行鉴定，鉴定结果为分子伴侣蛋白。

表2 双向电泳结果

表3 蛋白质谱鉴定和生物信息检索结果

通过对实验条件的摸索用离心结合超声破碎的方法提取全蛋白，然后取2 mg蛋白进行双向电泳，在固相PH梯度胶条为PH4-7范围内，可以得到分辨率和重复性都很好的蛋白图谱，用LC-MS/MS的方法成功鉴定了肺炎支原体标准株FH中3个蛋白点，鉴定结果为分子伴侣蛋白(Chaperone protein DnaK)，鉴定成功率为100%。

肺炎支原体是我国社区获得性肺炎首位致病菌，但其耐药现象在我国十分严重，对首选药物大环内酯类耐药率高达69%以上[10]，另一类有效抗生素喹诺酮类的最低抑菌浓度也在不断提升。利用蛋白质双向电泳技术开展MP的功能蛋白研究并寻找可能的耐药相关性蛋白，可为MP致病机理的研究和耐药的防治提供蛋白质组学的研究方法。

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Optimization of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis techniques formycoplasmapneumoniae

HUXuan1,YUANXin1,BAIChang-qing1,etal.

(1.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,theAffiliatedHospitaloftheAcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100071,China；2.InstituteofDiseaseControlandPrevention,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

Objective To develop a scheme of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis(2-DE) formycoplasmapneumoniae(MP).Methods The main factors of 2- DE technique,including protein precipitation,PH gradient gel strip range and protein sample size,were studied in this research.The standard FH electrophoresis map was compared and analyzed,and then some protein spots were identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).Results The proteins spots of FH were well distributed under the condition of whole protein extracted by centrifugal and ultrasonic fragmentation,the 2mg protein sample size,and PH 4-7.60±2 protein spots were detected in the maps.By using LC-MS/MS,protein identification results were molecular chaperone protein DnaK.Identification rate was 100%.Conclusion The 2-DE method for proteomics analysis of MP was successfully established which could be effectively used in the MP proteomics investigation.

Mycoplasma pneumoniae;proteomics;two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis

首都特色基金(Z141107002514182)；国家自然科学基金(81400009)

1007-4287(2016)12-2006-03

R392

A

胡璇(1987-)，女，硕士研究生，研究实习员，主要从事肺炎支原体对四环素类耐药机制的研究。

2016-05-15)

*通讯作者