人参皂苷Rg5对人食管癌细胞作用的研究

梅志宏,丁雅明,李 凡,付学奇，刘林林*，朱洪权*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041;2.吉林大学基础医学院；3.吉林大学生命科学院)

人参皂苷Rg5对人食管癌细胞作用的研究

梅志宏1,丁雅明1,李 凡2,付学奇3，刘林林1*，朱洪权1*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041;2.吉林大学基础医学院；3.吉林大学生命科学院)

目的 探索人参皂苷Rg5对人食管癌细胞Eca-109的作用及机制。方法 利用不同浓度人参皂苷Rg5在体外对人食管癌Eca109细胞作用不同时间，采用CCK-8法检测细胞抑制率，Annexin V-FITC/PI双染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率，PI单染法检测细胞周期。结果 在浓度分别为50、100 μmol/L的人参皂苷Rg5作用人食管癌细胞24 h后出现明显形态学变化，同时处于S期及G2/M期细胞较对照组明显增多,分别为53.08%、25.84%和58.44%、31.48%，流式细胞仪检测早期凋亡率分别为11.45%、30.13%。 结论 人参皂苷Rg5能抑制食管癌Eca-109细胞增殖，其机制可能为增加细胞早期凋亡，引起细胞周期滞留。

人参皂苷Rg5；食管癌细胞Eca109；细胞周期；凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:1982)

食管癌是常见的消化道肿瘤，2008年其全世界平均发病率居所有恶性肿瘤第9位；死亡率居第8位，而中国大陆食管癌发病率居全国各类恶性肿瘤第5位，死亡率高居第4位，显著高于国际平均水平[1]。居高不下的发病率及死亡率严重威胁人类的健康。目前食管癌的治疗手段主要是手术及放化疗治疗。因其解剖位置特殊，治疗效果一般，预后较差,应用新型药物延缓其复发和转移是提高其治疗疗效的手段之一。

人参皂苷Rg5是从人参中提取的稀有人参皂苷，Rg5能诱导多种肿瘤细胞凋亡，Shin-jung Kim[2]等人从细黑参中提取的Rg5已验证在人乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-453)、Li-dan Liang[3]等报道Rg5能诱导多种宫颈癌细胞凋亡和DNA损伤,然而在该人参单体对食管癌细胞的作用未见报道。本研究通过体外细胞实验证实人参皂苷Rg5对食管癌细胞具有抑制增殖作用，为临床治疗肿瘤开发新型中药提供一定的实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

该实验采用的食管癌细胞株Eca109细胞由吉林大学第二医院中心实验室保存。

1.1.2 人参皂苷Rg5

该实验所用人参皂苷Rg5单体由吉林大学生命科学院从人参中分离及提供本次实验。

1.1.3 主要试剂及实验耗材

RPMI-1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自由NQBB公司；青-链霉素双抗购自Gibco公司；凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC/PI为BD公司产品，周期检测试剂盒购自南京凯基生物公司，CCK-8为日本同仁产品。37℃恒温培养箱、酶标仪为Thermo公司设备，流式细胞仪为Beckman公司仪器。

1.2 方法

1.2.1 食管癌细胞抑制率检测

采用cck-8法检测细胞抑制率。取对数生长期的食管癌ECa109细胞4×104/ml，种于96孔板中，每孔100 μl，37℃孵育箱中培养24 h，并将Rg5稀释于不含血清的RPMI-1640培养基中，浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 μmol/L共5个浓度梯度，每组5个复孔，同时每组设置对照组(不加药物)，空白组(只含培养基)，细胞种于96孔板培养24 h后吸去完全培养基，每孔加入100 μl上诉含有不同药物浓度的培养基，空白组及对照组也相应加入不含血清培养基，37℃孵育箱继续培养24 h后每孔加入10 μl CCK-8,2h后酶标仪检测450 nm处吸光度。全部细胞抑制率=(对照组-加药组)/(对照组-空白组)×100%。

1.2.2 细胞生长状态观察

取对数生长期的Eca109细胞消化后种于6孔板中，每孔约3×105个。以每孔2 ml完全培养基下37℃培养箱中培育24 h，根据药物的浓度曲线及时间曲线，更换含有50、100 μmol/L药物浓度的不含血清培养基2 ml恒温箱培养24 h，同时设立对照组(不含药物)，倒置显微镜下观察其形态。

1.2.3 细胞凋亡检测

以Annexin V FITC/PI双染色法检测。取对数生长期的Eca109细胞消化后种于6孔板中，每孔约3×105个。以每孔2 ml完全培养基下37℃培养箱中培育24 h，根据药物的浓度曲线及时间曲线，更换含有50、100 μmol/L药物浓度的不含血清培养基2 ml恒温箱培养24 h，同时设立对照组(不含药物)。收集上述细胞及上清，1 000 rpm离心5 min后弃去上清，预冷的PBS洗2次，用1×缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1-5×106/ml，取100 ul上诉细胞悬液于5 ml流式管中，分别加入5 μl Annexin V/FITC和5 μl PI，室温避光15 min，流式细胞仪测定细胞凋亡，实验重复3次。

1.2.4 细胞周期检测

以PI(碘化丙啶)单染法检测。取对数生长期的细胞种于6孔板中，每孔3×105个，2 ml完全培养基37℃孵育24 h，更换含有Rg5浓度为50、100 μmol/L的培养基2 ml培养24 h，同时设对照组。收集培养基，每孔1 ml胰酶消化收集后离心1 000 rpm、5 min，PBS洗涤1次离心，弃去上清后加入预冷的体积分数为70%乙醇5 ml固定，4℃过夜，800 rpm离心5 min后PBS洗去固定液，加入配好的含有染色缓冲液、Rnase、PI的染色液400 μl，37℃避光水浴30 min后进行流式细胞检测，Modfit软件分析细胞周期，实验重复3次。

1.2.5 统计学分析

2 结果

2.1Rg5对细胞增殖的抑制作用 不同浓度的Rg5对Eca-109细胞作用后抑制其增殖，且随着浓度和时间的增加，其抑制率相应增加，经过SPSS软件分析，其24h的IC50为42.95μmol/L，48h的IC50为31.61μmol/L，我们选择近50、100μmol/L浓度进行以下实验。如表1。

Rg5作用Eca109细胞的时间不同，其细胞抑制率不同，随时间延长其抑制率增加，以50μmol/L浓度的Rg5观察不同时间对Eca109的抑制率，见表2。

表1 不同浓度Rg5作用不同时间后细胞抑制率( ±s，%)

表2 50 μmol/L的Rg5与食管癌细胞作用不同时间抑制率

2.2 不同浓度与Eca-109细胞作用后生长情况 镜下可见，随浓度增加，细胞形态发生明显变化，其体积变小，部分出现皱缩、变圆、脱落(图1)。

2.3 Rg5对Eca109细胞周期的影响 食管癌细胞的周期受到Rg5的影响，随着浓度的增加，其周期主要阻滞在G2/M、S期，而G0/G1比例相对减低。当以50、100 mol/L浓度作用细胞24 h后，其S期、G2期与对照组相比，有明显的差异性，具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

图1 不同浓度Rg5作用Eca-109细胞24 h后形态观察

组别G0/G1SG2/M对照组51．64±3．2238．22±2．8512．14±2．4650μmol/L组21．08±2．18∗53．08±3．34∗25．84±3．08∗100μoml/L组10．08±2．41∗58．44±4．05∗31．48±4．54∗

注：*与对照组相比，P<0.05

2.4 Rg5对Eca109细胞增殖的影响 分别用50、100 μmol/L浓度Rg5作用Eca109细胞后可见细胞凋亡率增加，且随浓度增加其早期凋亡率也增加。当以50、100 μmol/L浓度作用细胞24 h后，其早期凋亡率与对照组相比，有明显的差异性，具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同浓度Rg5作用Eca109细胞24 h凋亡情况

注：C1:坏死细胞；C2：晚期凋亡细胞；C3：正常细胞；C4：早期凋亡细胞；与对照组比较，*P<0.05

3 讨论

肿瘤的生长是一个复杂的过程，因其不能像正常细胞一样进行程序化凋亡而进行无限增殖，因此，如何诱导肿瘤细胞凋亡或产生细胞周期滞留致使细胞停止分裂或延迟分裂，是药物治疗肿瘤的最基本的几种作用方式。

人参是祖国传统医学中重要的药物，随着医学科技的发展，其多种成分已被分离出来形成单体[4]，其中人参皂苷Rg3，已被制成抗肿瘤中药应用于临床。Rg5作为一种新型人参单体，目前正被用于多种研究，Lee YY[5]等研究了Rg5在BV2小胶质细胞中的抗炎作用，Siddiqi[6]等报道了其在小鼠成骨细胞中的刺激作用，Chu[7]等人研究了人参皂甙Rg5通过减弱神经炎症反应改善STZ诱导记忆受损大鼠的认知功能障碍和β-淀粉样蛋白沉积等。本实验通过体外细胞实验证明其对食管癌细胞具有增殖抑制作用，这与之前报道的Rg5能诱导其他肿瘤细胞凋亡一致。本实验发现其抑制肿瘤细胞增殖通过影响细胞周期，主要是将细胞周期阻滞在S期和G2期，从而表现出其细胞毒作用，同时引发肿瘤细胞凋亡，并随着浓度增加，其凋亡率也相应增加。目前已有多项研究证实细胞周期阻滞与细胞周期蛋白的表达有关，而细胞凋亡途径主要有细胞膜途径，线粒体途径和内质网途径三种。当细胞经过药物作用后，经过某一种途径使细胞接受凋亡信号，会使凋亡调控分子进行相互作用，继而诱发细胞凋亡相关蛋白的活化，致使细胞凋亡。 Rg5诱导的细胞周期改变和早期凋亡的发生是否与上诉因素有关，还有待进一步研究。总体说来，本次实验证实人参皂苷Rg5能在体外实验中抑制食管癌细胞增殖，为临床开发治疗食管癌新药提供一定的实验基础。

[1]赫 捷,邵 康.中国食管癌流行病学现状、诊疗现状及未来对策[J].中国癌症杂志,2011,21(7):501.

[2]Shin-jung Kim，An Keun Kim,Anti-breast cancer activity of Fine Black ginseng (Panax ginseng Meyer) and ginsenoside Rg5[J].Journal of Ginseng Research,2015,39(2):125.

[3]Liang LD,He T,Du TW,et al,Ginsenoside-Rg5 induces apoptosis and DNA damage in human cervical cancer cells[J].Molecular Medicine Reports,2015,11(2):940.

[4]杨金玲,高丽丽,朱 平.人参皂苷生物合成研究进展[J].药学学报，2013,48(2):170.

[5]Lee YY，Park JS，Jung JS，et al.Anti-inflammatory effect of ginsenoside Rg5 in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells[J].Int J Mol Sci,2013,14(5):9820.

[6]Siddiqi MH，Siddiqi MZ，Ahn S，et al.Stimulative Effect of Ginsenosides Rg5:Rk1 on Murine Osteoblastic MC3T3-E1 Cells[J].Phytotherapy Research,2014，28(10):1447.

[7]Chu SH，Gu JF，Feng L,et al.Ginsenoside Rg5 improves cognitive dysfunction and beta-amyloid deposition in STZ-induced memory impaired rats via attenuating neuroinflammatory responses[J].Int Immunopharmacol,2014，19(2):317.

Effect of ginsenoside Rg5 on human esophageal cancer cells

MEIZhi-hong,DINGYa-ming,LIFan,etal.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China)

Objective To explore the effect and mechanism of ginsenoside Rg5 on human esophageal cancer cell line Eca-109.Methods The inhibitory rate of human esophageal cancer cell line Eca109 in vitro was measured by CCK-8 method.The apoptosis rate of cells was detected by flow cytometry after Annexin V-FITC / PI double staining.Cell cycle.Results After treated with ginsenoside Rg5 at concentrations of 50 and 100 μmol/L for 24 h,the morphological changes were observed,and the cells in S phase and G2/M phase were significantly higher than those in the control group (53.08%,25.84%% and 58.44%,31.48% respectively(P<0.05).The early apoptotic rates were 11.45% and 30.13% respectively by flow cytometry(P<0.05).Conclusion Ginsenoside Rg5 can inhibit the proliferation of esophageal cancer Eca-109 cells,and its mechanism may be to increase the early apoptosis of cells,causing cell cycle arrest.

ginsenoside Rg5;esophageal cancer cell Eca 109;cell cycle;apoptosis

国家自然科学基金重大国际合作项目(项目编号：81320108025)

1007-4287(2016)12-1982-04

R735.1

A

2016-05-09)

*通讯作者