RP-HPLC法同时测定菥蓂药材中7种黄酮苷的含量

程丽媛，梁 勇，罗 轩，刘 旭，杨 华，王立升

(1.广西大学化学化工学院， 广西南宁530004；2.南宁骄阳医药科技有限公司， 广西南宁530003)

RP-HPLC法同时测定菥蓂药材中7种黄酮苷的含量

程丽媛1，梁 勇2，罗 轩1，刘 旭1，杨 华1，王立升1

(1.广西大学化学化工学院， 广西南宁530004；2.南宁骄阳医药科技有限公司， 广西南宁530003)

建立了一种可以对菥蓂药材中5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮、异肥皂草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草苷和大波斯菊苷的含量进行同时测定的RP-HPLC法。色谱条件：色谱柱为Agilent C18柱(4.6×150 mm, 3.5 μm)；流动相为乙腈-0.4%冰醋酸水溶液，梯度洗脱；流速1.0 mL/min；检测波长273 nm；柱温35 ℃。结果表明，在上述色谱条件下，5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮、异肥皂草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草苷和大波斯菊苷的质量浓度分别在5.67～56.7 μg/mL(r=0.999 7)，10.92～109.2 μg/mL(r=0.999 4)，5.76～57.6 μg/mL(r=0.999 8)，4.92～49.2 μg/mL(r=0.999 8)，13.95～139.5 μg/mL(r=0.999 9)，5.25～52.5 μg/mL(r=0.999 8)，5.22～52.2 μg/mL(r=0.999 7)范围内与色谱峰的峰面积呈现良好的线性关系，平均加样回收率均在97%～101%，RSD均小于2.7%。该分析方法简便、快速、准确且重现性好，为有效地监控菥蓂药材的质量提供了可靠方法。

菥蓂；RP-HPLC；黄酮苷；含量同时测定

菥蓂(ThlaspiarvenseL.) 系十字花科菥蓂属一年生草本植物，又名遏蓝菜、败酱草、犁头草、寨卡等。我国菥蓂资源极为丰富，全国各地均有分布[1]。菥蓂作为我国传统中草药，其全草、嫩苗、种子均可入药，具有清肝明目、清热利尿等功效，临床上可用于治疗肾炎、子宫内膜炎等疾病[2-4]。同时，菥蓂是广西花红片的重要成分[5]。菥蓂及菥蓂籽均具备抑菌和显著的体外抗肿瘤活性[6-7]。

黄酮类化合物广泛存在于自然界中，是植物体次级代谢产生的一类天然有机化合物，具有抗炎、保护心脑血管以及抗癌等活性[8-11]。菥蓂中黄酮成分含量较高且种类丰富。成日青等[12]将菥蓂经石油醚脱脂，使用70%乙醇加热回流提取，测得总黄酮含量为5.26 mg /g；于金英等[13]通过高效液相色谱—电喷雾质谱联用技术，对菥蓂水提醇沉物中的主要黄酮成分进行分析和鉴定，共鉴定出 15 个黄酮类化合物。

笔者所在课题组的研究表明，菥蓂中的黄酮具有较强的抗炎活性，这与菥蓂治疗炎症疾病的作用相符[14]。但传统研究仅限于菥蓂黄酮类化合物的分离，缺乏对各黄酮单体含量的测定研究，因此，有必要对菥蓂黄酮活性单体的含量进行分析，为有效地保证其临床疗效提供参考。

反相液相色谱法 (RP-HPLC)是一种常用于中草药中多种化学成分含量同时测定的方法，该法简便、快速、准确、重复性好[15]。

本研究建立了菥蓂药材中5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮、异肥皂草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草苷和大波斯菊苷等7种黄酮苷(化学结构式见表1)的RP-HPLC同时测定法，旨在为更有效全面的监控菥蓂药材的质量提供理论依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪，Agilent 化学工作站( 美国安捷伦科技有限公司);FA1104B电子分析天平(上海越平科学仪器有限公司);ZK-82B干燥箱(上海博迅实业有限公司);HH-S2数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂);UV-T6紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

甲醇(色谱纯，西陇化工股份有限公司);冰醋酸(分析纯，上海申博化工有限公司);水(纯净水，娃哈哈集团有限公司);异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草苷和大波斯菊苷对照品(含量质量分数≥98%，成都植标化纯生物科技有限公司);5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮和异肥皂草苷(实验室自制，经核磁和质谱确证结构，采用HPLC峰面积归一化法计算含量，纯度均大于98%)；菥蓂药材样品由广西壮族自治区柳州花红药业股份有限公司鉴定并提供。

表1 菥蓂中7种黄酮苷的化学结构
Tab.1 Structures of seven flavonoids inThlaspiarvenseL.

化合物结构5，7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮异肥皂草苷异荭草苷牡荆苷异牡荆苷木犀草苷大波斯菊苷

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为Agilent C18柱(4.6×150 mm，3.5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.4%冰醋酸水溶液(B)；梯度洗脱：0 min: A-B(5∶95)，20 min: A-B(10∶90)，90 min: A-B(30∶70)； 流速为1.0 mL/min；检测波长为273 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。

在上述色谱条件下，取供试品溶液进样分析，进样量20 μL，理论塔板数不低于7 000。5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮、异肥皂草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草苷和大波斯菊苷的相邻色谱峰之间分离良好，分离度大于1.5，符合分离要求[16-17]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称定7种黄酮苷对照品，使用体积分数80%甲醇水溶液进行溶解，并分别转移至10 mL容量瓶中稀释至刻度，摇匀，得各对照品储备液，4 ℃冷藏，备用。分别精密量取各对照品储备液适量置于同一50 mL容量瓶中，加80%甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，得到5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮141.75 μg/mL，异肥皂草苷273.00 μg/mL, 异荭草苷144.00 μg/mL，牡荆苷123.00 μg/mL，异牡荆苷348.75 μg/mL，木犀草苷131.25 μg/mL，大波斯菊苷130.65 μg/mL的混合对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备

称取干燥菥蓂全草粗粉1.0 g，置于50 mL圆底烧瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，称定重量并记录，80 ℃水浴加热回流萃取1.0 h，冷却至室温后滴加80%甲醇补足失重，摇匀。于3 000 r/min下离心5 min，取上清液，使用0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液。

2.3 线性关系的考察

精密移取上述对照品储备液1.0、1.5、2.5、5、7.5、10 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加80%甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，得不同浓度的混合对照品溶液。按“2.1节”色谱条件，使用高效分析液相进行分析。以对照品溶液浓度(X)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得到7种黄酮苷的标准曲线回归方程，见表2。

表2 回归方程、线性范围和相关系数(n=6)
Tab.2 Regression equations, linear ranges and correlation coefficients(n=6)

化合物回归方程相关系数R线性范围/(μg·mL-1)5，7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮y=50273x+954509997567～567异肥皂草苷y=42498x+0161099941092～1092异荭草苷y=42943x-1079209998576～576牡荆苷y=40424x-542209998492～492异牡荆苷y=51347x-6634099991395～1395木犀草苷y=39749x-1388609998525～525大波斯菊苷y=38807x-252209997522～522

2.4 精密度实验

取混合对照品溶液，按照“2.1节”色谱条件，连续重复进样6次，记录色谱图，测定其峰面积，5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮、异肥皂草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草苷和大波斯菊苷峰面积的RSD分别0.80%、1.05%、0.74%、0.73%、0.91%、0.85%、0.76%，均不超过2%，结果表明色谱仪的精密度符合要求。

2.5 稳定性试验

制取一供试品溶液，在室温下放置，按“2.1节”色谱条件，分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样分析，测定其峰面积。结果表明，7种黄酮苷成分在24 h内稳定，5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮、异肥皂草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草苷和大波斯菊苷峰面积的RSD分别为1.35%, 0.80%, 0.73%, 0.73%, 0.91%, 0.85%, 0.76，均不超过2%，符合稳定性要求。

2.6 重复性试验

准确称取菥蓂药材样品6份，每份1.0 g，依“2.2.2节”的方法操作，在“2.1节”色谱条件下测得菥蓂药材中5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮平均含量为32.55 μg/mL，RSD为1.9 %;异肥皂草苷平均含量为77.21 μg/mL，RSD为1.3 %;异荭草苷平均含量为17.17 μg/mL，RSD为1.4 %;牡荆苷平均含量为12.56 μg/mL，RSD为1.5 %;异牡荆苷平均含量为12.56 μg/mL，RSD为1.6 %;木犀草苷平均含量为23.02 μg/mL，RSD为1.2 %;大波斯菊苷平均含量为17.57 μg/mL，RSD为1.5 %。说明重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称定已知含量的菥蓂药材样品9份，每份1.0 g，按低、中、高浓度分别加入1.0、2.0、3.0 mL的混合对照品溶液，每一浓度平行操作3次，按“2.2.2节”下的方法操作，在“2.1节”色谱条件下进行测定，记录色谱图测量峰面积，计算回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果(n=9)
Tab.3 Results of recovery test (n=9)

化合物回收率/%低中高平均回收率/%RSD/%5，7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮964101998899027异肥皂草苷9721014101099823异荭草苷97399899798914牡荆苷974100099699014异牡荆苷972100299799116木犀草苷96899199898615大波斯菊苷97799699698911

2.8 样品含量的测定

取3批菥蓂药材，按“2.2.2节”的方法操作，制备供试品溶液并在上述色谱条件下进行测定，每份平行测定3次，采用外标法分别计算菥蓂药材样品中5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮 (a)、异肥皂草苷 (b)、异荭草苷 (c)、牡荆苷 (d)、异牡荆苷 (e)、木犀草苷 (f)和大波斯菊苷 (e)的含量。标准品和供试品液相谱分别如图1和图2所示。结果表明，5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮平均含量为0.65 mg/g，异肥皂草苷平均含量为1.34 mg/g，异荭草苷平均含量为0.34 mg/g，牡荆苷平均含量为0.25 mg/g，异牡荆苷平均含量为1.57 mg/g，木犀草苷平均含量为0.46 mg/g，大波斯菊苷平均含量为0.35 mg/g。

图1 混合对照品液相色谱图

Fig.1 Chromatograms of the mixture of standards

图2 供试样品液相色谱图

Fig.2 Chromatograms of the sample

3 讨 论

3.1 提取方法

文献[16-17]中，分别使用50%甲醇和80%甲醇作为提取溶剂进行提取，使用高效分析液相对提取液进行分析，结果表明，使用20倍量的80%甲醇回流提取1 h,总黄酮含量较高，可见选择该方法为最佳提取方法。

3.2 流动相系统

考察了甲醇—水、乙腈—水、甲醇-0.05%磷酸水溶液及乙腈-0.04%冰醋酸水溶液流动相系统，结果显示，采用乙腈-0.04%冰醋酸水溶液系统为流动相时所得到的色谱图基线平稳，7种黄酮苷的分离效果较好，因此，选择乙腈-0.04%冰醋酸水进行梯度洗脱。

3.3 检测波长的选择

图3 紫外全波长扫描Fig.3 The results of UV wavelength scanning

取上述7种黄酮类成分的混合对照品进行紫外全波长扫描，结果如图3所示，273 nm处有最大吸收峰，故选择273 nm作为检测波长进行测定，各成分均能得到较好的响应值。

3.4 结果分析

采用本文建立的RP-HPLC法对菥蓂药材中7种黄酮苷成分的含量进行同时测定，结果如图2、图3所示，表明广西壮族自治区柳州花红药业股份有限公司所提供的菥蓂药材中7种黄酮苷成分的平均含量由高到低依次为异牡荆苷、异肥皂草苷、5, 7-二羟基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黄酮、木犀草苷、大波斯菊苷、异荭草苷。其中，异牡荆苷和异肥皂草苷在菥蓂药材中含量较高。

3.5 结 论

针对菥蓂药材中主要含有的7种黄酮苷类单体化合物，本研究首次建立了相应RP-HPLC法对其含量进行同时测定。该方法重复性好，准确快速，可为菥蓂药材的质量控制提供重要参考。

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(责任编辑 张晓云 裴润梅)

Simultaneous determination of seven flavonoids in Thlaspi arvense L.by RP-HPLC

CHENG Li-yuan1, LIANG Yong2, LUO Xuan1, LIU Xu1, YANG Hua1, WANG Li-sheng1

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China;2.Nanning Jiaoyang Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Nanning 530003, China)

A RP-HPLC method for simultaneous determination of 5, 7-dihydroxy-flavone-4′-(6″-O-β-D-glucopyranoside)-O -β-D-glucopyranoside, isosaponarin, isoorientin, vitexin, isovitexin, luteolin-7-O-β-D-glucoside and apigenin-7-O-β-D-glucoside inThlaspiarvenseL was established. The separation was performed on an Agilent C18column (4.6×150 mm, 3.5 μm) with a gradient elution composed of acetonitrile and 0.4% acetic acid aqueous solution. The column temperature was set at 35 ℃, and the flow rate was 1.0 mL/min. The detective wavelength was set at 273 nm. The results indicated that the linear range was 5.67～56.7 μg/mL (r=0.999 7)，10.92～109.2 μg/mL (r=0.999 4)，5.76～57.6 μg/mL (r=0.999 8)，4.92～49.2 μg/mL (r=0.999 8)，13.95～139.5 μg/mL (r=0.999 9)，5.25～52.5 μg/mL (r=0.999 8)，and 5.22～52.2 μg/mL (r=0.999 7), respectively (n=6). The average recoveries (n=3) of seven flavonoids were 97%～101%, and the RSDs were less than 2.7%. The method is simple, rapid, accurate and reproducible, and can be effectively used for the quality control ofThlaspiarvenseL.

ThlaspiarvenseL; RP-HPLC; flavonoids;simultaneous determination

2016-05-17；

2016-06-27

广西自然科学基金重点项目(2010GXNSFD013040); 广西科技攻关项目(桂科攻11107010-3-5)

王立升(1965—)，男，黑龙江汤原人，广西大学教授；E-mail: w_lsheng@163.com。

程丽媛，梁勇，罗轩，等.RP-HPLC法同时测定菥蓂药材中7种黄酮苷的含量[J].广西大学学报(自然科学版)，2016，41(6)：2053-2059.

10.13624/j.cnki.issn.1001-7445.2016.2053

R917

A

1001-7445(2016)06-2053-07