常用消毒剂对不同材料表面克罗诺杆菌的影响

牛婕婷，潘瑞丽，周彦宏，娄彬彬，姜霞，赵思雨，费鹏，满朝新，姜毓君

(东北农业大学a.食品学院乳品科学教育部重点实验室；b.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150030)

常用消毒剂对不同材料表面克罗诺杆菌的影响

牛婕婷a，潘瑞丽a，周彦宏a，娄彬彬a，姜霞a，赵思雨a，费鹏a，满朝新b，姜毓君ab

(东北农业大学a.食品学院乳品科学教育部重点实验室；b.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150030)

以5株分离自婴儿配方乳粉及其加工环境中的克罗诺杆菌为研究对象，研究常用消毒剂对不锈钢、聚四氟乙烯和玻璃这3种材料表面克罗诺杆菌的影响。结果表明：当3种消毒剂处于一定浓度时，不锈钢表面残存活菌数量明显多于玻璃表面残存活菌数量且存在显著性差异。当过氧乙酸和过氧化氢的质量浓度为分别为3 g/L和35 g/L，二氧化氯为3 g/L时，在3种料上均未检测出克罗诺杆菌。本研究为婴儿配方乳粉生产及储存过程中克罗诺杆菌的防控提供理论依据，有助于选择合适材质减少克罗诺杆菌对婴儿配方乳粉污染的可能。

克罗诺杆菌；不锈钢；聚四氟乙烯；玻璃；消毒剂

0 引言

克罗诺杆菌(Cronobacter)原名阪崎肠杆菌(Entero⁃bacter sakazakii)[1-2]，是婴儿配方乳粉(powdered infant formula，PIF)中的A类致病菌[3-5]，能够通过污染PIF造成新生儿感染[6-8]，致死率高达40%～80%[9-11]。目前已有消毒剂对克罗诺杆菌菌悬液的抑菌效果的相关报道[12-13]，同时一些研究者发现克罗诺杆菌粘附在不同材料会导致杀菌效果的差异，但是关于不同材料对消毒剂抑菌效果影响的研究并不全面。本实验选取分离自加工环境和成品的5株克罗诺杆菌，选取乳粉加工环境中常见的三种接触材料不锈钢、玻璃、聚四氟乙烯[14]，以及常用消毒剂过氧乙酸、二氧化氯、过氧化氢，来研究不同材料表面对克罗诺杆菌消毒作用的影响，对于更好的控制和消除克罗诺杆菌的污染、指导婴儿配方乳粉的生产具有重要的意义。

1 实验

1.1菌株

本实验所用5株克罗诺杆菌分离自不同地区的婴幼儿配方粉生产企业加工环境和婴幼儿配方粉样品。详细信息如表1所示。

1.2表面试验材料

不锈钢片(SUS 304，2 cm×2 cm)，玻璃片(2 cm× 2 cm)，聚四氟乙烯片(2 cm×2 cm)。

1.3仪器与设备

生物超净工作台，离心机，pH计，恒温培养箱，灭菌锅，超声清洗仪，振荡器，电子天平。

表1 实验用菌株及其来源

1.4主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)，胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，甘油，DE中和培养基，吐温-80，食品级过氧化氢消毒剂、食品级二氧化氯消毒剂、食品级过氧乙酸消毒剂，NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，CaCO3。

1.5方法

1.5.1 克罗诺杆菌的菌悬液制备

取出-20℃甘油保存的含有克罗诺杆菌的冻存管，按质量分数为2%的接种量接于TSB液体培养基，37℃培养12 h进行活化，将活化后的菌株在TSA固体培养基上进行三区划线，37℃培养24 h后挑取单菌落，置于10 mL液体TSB培养基中进行纯培养，在转速为4 000 r/min，15 min离心得菌沉淀，将菌沉淀重悬于用PBS溶液中进行洗涤两次，最后用PBS溶液进行稀释，调整初始菌液浓度最终达到每片8.0（对数值）。

1.5.2 染菌材料的制备

材料的清洗和灭菌:将不锈钢片和玻璃片用15%磷酸溶液超声20 min,用蒸馏水洗净，清洗后的不锈钢和玻璃片，待干燥后，放入玻璃平皿中，然后将玻璃平皿放入烘箱170℃，3 h进行干热灭菌待用，将聚四氟乙烯片放入体积分数为75%酒精中浸泡12 h待用。

材料表面接种：分别取100 μL菌悬液滴加到3种不同材料表面上，在生物安全柜中在室温下，干燥2 h。

1.5.3 消毒剂的稀释和中和剂的配置

（1）消毒剂的稀释

将食品级过氧乙酸消毒剂(质量浓度为160 g/L)使用灭菌的硬质水（0.4 g，1 L蒸馏水）稀释到质量浓度分别为1，1.5，2，2.5，3 g/L。

将食品级二氧化氯消毒剂使用无菌的硬质水稀释到0.5，1，1.5，2，2.5，3 g/L。

将食品级过氧化氢消毒剂(质量浓度350 g/L)使用灭菌的硬质水稀释成质量浓度为10，15，20，25，30，35 g/L。

（2）中和剂的配置

取34 g DE中和培养基，5 g吐温80溶解于1 L蒸馏水中[15]，分装到50 mL的离心管中，121℃，15 min灭菌，待用。

1.5.4 消毒液对3种染菌材料的杀菌实验

取200 μL的不同稀释浓度的消毒剂分别滴加到材料表面的接种点上的，完全覆盖之前的干燥菌液，处理10 min，作用完马上将处理的材料放入已灭菌的含有10 mL的DE中和肉汤培养基和3 g玻璃珠（直径0.5 mm）50 mL的离心管中，立即终止作用，中和作用5 min后以最大转速离心1 min进行彻底洗脱。将洗脱液进行梯度稀释，取100 μL的混合液均匀涂布于TSA固体培养基上，37℃倒置培养48 h，培养时间的延长是为了使未致死的细胞能完全恢复，最后观察克罗诺杆菌的生长情况，进行菌落计数，结果以每片的对数值表示，所有实验重复3次。无菌硬质水滴加到接种点，处理相同时间作为空白对照。

1.6统计分析

采用SPSS公司(SPSS inc.)统计软件SPSS v17.0将数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1过氧乙酸对不同材料表面克罗诺杆菌杀菌作用试验

通过梯度稀释平板计数的方法，对5株克罗诺杆菌在不同材料表面用过氧乙酸消毒剂处理后的情况进行差异性分析，结果如表1所示。5株菌当用过氧乙酸质量浓度为3 g/L处理后时，均未检测出克罗诺杆菌。克罗诺杆菌ES3在过氧乙酸质量浓度为1 g/L和2.5 g/L时，在不锈钢片，聚四氟乙烯片，玻璃片三种材料表面上没有呈现出明显的差异；而当过氧乙酸质量浓度为1.5 g/L和2 g/L时，在不锈钢片和玻璃片上存在明显差异(P<0.05)。克罗诺杆菌ES35在过氧乙酸质量浓度为1，1.5，2 g/L时，在不锈钢片上和聚四氟乙烯片上未出现明显差异，而这两种材料均与玻璃片之间呈现出明显差异（P<0.05），在过氧乙酸质量浓度达到2.5 g/L时，不锈钢片和聚四氟乙烯片出现了显著性差异（P<0.05），而聚四氟乙烯与玻璃片却未出现明显差异。克罗诺杆菌ES45和ES46质量浓度均在1，1.5，2，2.5 g/L时，在不锈钢和玻璃片上存在显著性差异。ES52在质量浓度为1.5 g/L和2 g/L时，在不锈钢和玻璃片上存在显著性差异。因此可以判定，5株菌当用过氧乙酸处于中间质量浓度1.5 g/L和2 g/L处理后，在不锈钢片上和玻璃片上均存在显著性的差异（P< 0.05），不锈钢片上的菌存活量较玻璃片上存活的菌多。

表1 过氧乙酸对不同材料表面克罗诺杆菌杀菌作用

表2 二氧化氯对不同材料表面克罗诺杆菌杀菌作用

2.2二氧化氯对克罗诺杆菌杀菌作用

5株克罗诺杆菌在不同材料表面进行二氧化氯消毒剂的处理试验的差异性分析结果如表2所示。5株菌在二氧化氯浓度为3 g/L处理时，在3种材料上均未检测出有菌。5株菌在二氧化氯浓度为1.5 g/L时，在不锈钢片，聚四氟乙烯片，玻璃片三者之间均呈现出显著性差异（P<0.05）。5株菌在二氧化氯浓度为0.5，1，1.5，2.5g/L时，不锈钢和玻璃片两者之间呈现出显著性差异（P<0.05）。总体来说，在二氧化氯的浓度处于中低浓度时，在不锈钢和玻璃片之间呈现出显著性差异（P<0.05），不锈钢片上的菌存活量较玻璃片上存活的菌多。

2.3过氧化氢对克罗诺杆菌杀菌作用

5株克罗诺杆菌在不同材料表面进行过氧化氢消毒剂的处理试验的差异性分析如表3所示。5株菌当用过氧化氢质量浓度为35 g/L处理后，在三种材料上均未检测出有菌。5株菌在用过氧化氢质量浓度小于30 g/L处理后，在不锈钢片和玻璃片上都存在显著性差异（P<0.05）。由此可以推断，当用过氧化氢消毒剂处理时，在不锈钢和玻璃片间存在显著性差异（P< 0.05），而这种差异主要表现在过氧化氢处于中低质量浓度时。

表3 过氧化氢对不同材料表面克罗诺杆菌杀菌作用

通过以上3种消毒剂对不锈钢、聚四氟乙烯和玻璃表面克罗诺杆菌杀菌作用的试验结果来看，当3种消毒剂处于一定浓度时，不锈钢表面残存活菌数量明显多于玻璃表面残存活菌数量，这一结果与张娜[14]等人的研究结果相一致。不锈钢和玻璃片之间的显著性差异可能是由于不锈钢片表面粗糙，具有明显的沟壑结构，在用消毒剂处理时，更有利于菌的存活。而玻璃片表面较光滑所以活菌数较少。因此,由本研究可推断出，材料表面的粗糙度是影响消毒剂对表面杀菌效果的重要因素之一。

3 结论

通过3种化学消毒剂过氧乙酸、二氧化氯、过氧化氢对在不锈钢片、聚四氟乙烯片、玻璃片上的克罗诺杆菌进行杀菌处理，结果表明，当过氧乙酸、过氧化氢的质量浓度分别为3 g/L和35 g/L，二氧化氯为3 g/L时，在3种材料上均未检测出克罗诺杆菌。且当3种消毒剂浓度处于中间浓度时，不锈钢表面残存活菌数量明显多于玻璃表面残存活菌数量，存在显著性差异。

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《中国乳品工业》杂志摘要写作要求

1摘要写作要求

按报道性摘要书写，字数300字左右，以提供文章内容梗概为目的，不加评论及补充解释，摘要中应包括研究目的、方法及过程、结果与结论、创新性和创新点。中英文摘要内容应一致。

2摘要写作注意事项

2.1 着重反映新内容和特别强调的观点。

2.2 排除在本学科领域已成常识的内容。

2.3 不得简单地重复题名中已有的信息。

2.4 书写要合乎语法、保持上下文的逻辑关系。

2.5 结构要严谨，表达要简明，语义要确切，不分段落。

2.6 用第三人称的写法。应采用“对……进行了研究”、“报告了……现状”、“进行了……调查”等记述方法，不要使用“本文”、“作者”等为主语。

2.7 采用规范化的名词术语（包括地方、机构名和人名）。

2.8 缩略语、略称、代号，除了相邻专业的读者也能清楚理解的以外，在首次出现处必须加以说明。

3英文摘要写作注意事项

3.1 避免在摘要的第一句重复使用题目或题目的一部分。

3.2 用简洁、明确的语言（一般不超过150个单词），尽量用短句并避免句型单调。

3.3 描述作者的工作一般用过去时态，陈述由这些工作所得的结论时用现在时态。

3.4 尽量用主动语态代替被动语态。

3.5 尽量用语义清楚并为人熟知的词汇，对于大众熟知的缩写语可直接使用。

Effects of common disinfectants on the survival of Cronobacter spp.on the surfac⁃es of different materials

NIU Jie-tinga,PAN Rui-lia,ZHOU Yan-honga,LOU Bin-bina,JIANG Xiaa,ZHAO Si-yua,FEI Penga, MAN Chao-xinb,JIANG Yu-juna,b
(Northeast Agricultural University a.Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,College of Food Science；b.Na⁃tional Research Center of Dairy Engineering and Technology，Harbin 150030，China)

5 strains of Cronobacter isolated from PIF and production processing were as the research object in this study.The research was car⁃ried out to study the effects of common disinfectants on the survival of Cronobacter spp.on the surfaces of stainlesssteel,teflon and glass.The results showed that:when the concentration of the disinfectants in the middle,the log CFU/coupon of Cronobacter on stainless steel surface was more than that on glass surface,there was a significant difference.When the w/v of peracetic acid,chlorine dioxide,hydrogen peroxide was 0.3%,3 000 ppm and 3.5%,respectively,Cronobacter spp.were not detected on the material surfaces.This study provided theoretical basis for the prevention and control,did contribute to select suitable materials to reduce the contamination of Cronobacter in powdered infant for⁃mula.

Cronobacter；stainless steel；teflon；glass；disinfectants

TS252.1

A

1001-2230（2016）09-0012-04

2016-01-07

国家科技支撑计划课题（2013BAD18B11）；黑龙江省杰出青年基金项目（JC201415）；黑龙江省科研机构创新能力提升专项计划项目（YC13D005）。

牛婕婷（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

姜毓君