不同材质砧板对卤猪舌中单增李斯特菌到黄瓜转移率的影响

宋筱瑜,陆冉冉,汪 雯,董庆利,刘 箐

(1.国家食品安全风险评估中心，北京100021； 2.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093；3.农业部农产品质量安全风险评估实验室(杭州)，浙江杭州310021；4.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江杭州310021)

不同材质砧板对卤猪舌中单增李斯特菌到黄瓜转移率的影响

宋筱瑜1,陆冉冉2,汪 雯3，4,董庆利2,刘 箐2

(1.国家食品安全风险评估中心，北京100021； 2.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093；3.农业部农产品质量安全风险评估实验室(杭州)，浙江杭州310021；4.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江杭州310021)

为探究不同材质砧板对卤猪舌中单增李斯特菌到黄瓜转移率的影响，选定木质、塑料和不锈钢为材质研究对象，根据消费者生活习惯设定砧板放置时间0、6和18 h，按照文献调研结果设定4种常见的场景，模拟家庭厨房食品制备过程，测定单增李斯特菌在卤猪舌、砧板和黄瓜之间的污染水平。同时，6和18 h后切黄瓜的试验中，通过结晶紫染色与显微镜观测，分析不同材质砧板上单增李斯特菌的生物菌膜形成情况。结果表明：4种场景下，砧板到黄瓜的转移率变化趋势相似，即同种材质砧板场景1、2、3和4呈现依次递减的趋势；不同材质砧板同种场景下，木质砧板到黄瓜的转移率较高，塑料和不锈钢砧板的转移率近似。此外，6和18 h单增李斯特菌膜并未形成，即短时间内散状的菌落个体无法繁殖成环状的菌膜结构。

单增李斯特菌；砧板；交叉污染；转移率；菌膜

近年来，交叉污染引起的食品安全事故频发，家庭食源性疾病发生的重要原因之一是物体表面和食品接触面之间的交叉污染，包括即食食品接触受污染的食物原料、砧板和抹布等各种介质，这一途径所导致的交叉污染是当前国内外研究的热点与难点[1]。单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌，Listeriamonocytogenes)被WTO列为“四大食源性病原菌”之一，可引起人畜共患的传染病，死亡率高达30%左右[2]，其在自然界中广泛存在，对人体健康危害极大。单增李斯特菌可以黏附、生长于食品及接触器皿表面，在菌体-菌体和菌体-接触面的相互作用下，通过菌体增殖、分泌胞外基质形成具有一定空间结构的细菌聚集体，该聚集体则被称为生物菌膜[3]，生物菌膜对食品安全具有极大的威胁，已有研究证实多起食物中毒是由单增李斯特菌生物菌膜引发的[4]，研究表明，温度、pH和离子强度等环境条件以及微生物生长的营养条件，都会影响生物菌膜的形成，食品接触材料对生物菌膜形成能力的影响引起了广泛的关注。

砧板作为菜肴烹饪不可缺少的器具，其材质差异对微生物生存和转移的影响重大，家庭厨房常见的3种材质砧板分别是木质、塑料和不锈钢。研究表明：木质砧板表面的裂缝能给微生物提供合适的生存环境，是食品病原菌的潜在来源[5]。20世纪70年代，塑料砧板问世，在一些家庭中逐渐替代了木质砧板，但也被认为是交叉污染的良好媒介[6]。在显微镜观测下，塑料砧板很粗糙，表面存在许多细小孔洞，而这些孔洞可能会给微生物生殖繁殖提供场所[7]。此外，Klontz等[8]研究报道，1 620个研究对象中，25%的消费者在处理过原料肉或鸡肉后再次使用砧板时不做任何处理。Licohen等[9]发现切过肉类再切蔬菜时，5%的消费者会干擦砧板，24%的消费者会用水冲一下砧板，17%的受访者表示会使用洗洁剂等清洁砧板。

本实验按照调查得出的消费者习惯分别设计4种场景，选择木质、塑料和不锈钢砧板为食品接触材料研究对象，模拟家庭厨房食品制备过程，测定单增李斯特菌在卤猪舌、砧板和黄瓜之间的转移情况，研究不同材质砧板对单增李斯特菌在生熟食品交叉污染中的影响；同时，根据实际情况设定检测间隔时间，分析不同砧板材质上单增李斯特菌的生物菌膜形成情况，旨在通过食品加工环境对食源性致病菌的有效控制提供理论，为食品安全提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

生鲜蔬菜选择黄瓜，因黄瓜切片后表面平坦，可以增强试验的重现性[10]。熟肉制品选择市售某种真空包装卤猪舌，两者均购于上海卜蜂莲花超市。

TSA-YE培养基、TSB-YE培养基、PALCAM培养基和结晶紫染液，均购于山东青岛海博生物技术有限公司。

1.2 设备与砧板材质

YXQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗器械厂；SSW-CJ-IC型净化工作台，上海跃进医疗器械厂；XW-80A型漩涡混合器，上海精科实业有限公司； HWS-150型恒温恒湿培养箱，上海比朗仪器有限公司；MJ-180B-Ⅱ型生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；100～1 000 μL移液枪，芬兰百得实验室仪器(苏州)有限公司；Scientz-09型无菌均质器，浙江宁波新芝生物科技股份有限公司；BCD-189S型冰箱，松下电器(中国)有限公司。

Suncha原木菜板，浙江双枪竹木有限公司；lock&lock抗菌砧板CSC543，乐扣乐扣公司；SUS304食品级不锈钢菜板，无锡金凡金属制品有限公司；次氯酸钠，有效氯质量浓度8 000～10 500 mg/L。

1.3 菌种选用、活化及菌悬液制备

单增李斯特菌(ATCC 19116血清型4c)用无菌接种环从安碚管中接取一针于TSB-YE液体培养基中，在30 ℃的恒温摇床中培养18～24 h，然后在TSA-YE固体培养基上进行之字形划线，并于37 ℃的恒温恒湿培养箱中培养24 h[11]。反复3次，进行菌种活化，用无菌生理盐水(0.85% NaCl溶液)稀释，制得108CFU/mL初始菌悬液。

1.4 介质接种与场景设计

于无菌超净台内称取25 g卤猪舌，置于洁净器皿上，移液枪移取1 mL初始菌悬液于卤猪舌表面，并用无菌钳翻动卤猪舌数次，确保单增李斯特菌较均匀黏附在其表面，然后静置15 min。交叉污染流程如图1所示。将静置后的卤猪舌放置在灭菌木质砧板5 cm×5 cm(本试验所用的木质、塑料和不锈钢砧板统一切割成5 cm×5 cm的正方形)上，用无菌刀具模拟厨房操作，将其切片摆盘，再改切生黄瓜成片，其中，改切生黄瓜的时间依据同餐准备、相隔一上午(或下午)以及相隔一晚上和一上午分别设置为0、6和18 h。塑料砧板与不锈钢砧板同木质砧板操作。图1中的4种场景依据消费者生活习惯设定处理黄瓜的间隔时间：0、6和18 h。图中的S为不同场景；下标x为w时表示木质砧板，为p时表示塑料砧板，为s时表示不锈钢砧板。

1.5 0 h不同材质砧板4种场景下带菌量测定

共设计4种厨房常见场景，场景1为砧板不处理，场景2、3和4为砧板处理。场景1是切完卤猪舌后砧板不做任何处理，采用擦拭取样法对砧板带菌量进行测定，刀具与手进行无菌处理，再切无菌黄瓜10次；场景2为用无菌布擦拭砧板，同场景1方法对砧板带菌量进行测定，刀具与手进行无菌处理，再切无菌黄瓜10次；场景3为用500 mL无菌水冲洗砧板，简单沥干水渍，同上方法对砧板带菌量进行测定，刀具与手进行无菌处理，再切无菌黄瓜10次；场景4为用洗洁精、500 mL无菌水冲洗砧板，简单沥干水渍，同上方法对砧板带菌量进行测定，刀具与手进行无菌处理，再切无菌黄瓜10次。立即切黄瓜的操作，卤猪舌和生黄瓜片的带菌量按照文献[12]进行定量。砧板上单增李斯特菌的采集使用擦拭取样法进行测定[13]，0 h共重复试验10次。

1.6 6和18 h不同材质砧板4种场景下菌膜检测

隔6和18 h再切取黄瓜，与0 h切黄瓜的操作不仅在切黄瓜的时间上有不同处，后期检测方法也不同。将处理了卤猪舌后根据场景1、2、3和4清洗的5 cm×5 cm木质、塑料和不锈钢砧板，放置于直径90 mm的平皿中，并于25 ℃的培养箱内静置6与18 h。计数前用无菌水冲洗以去除表面未黏附的游离菌体，洗涤2次，室温风干。将3种材质的小正方形放入80 mL灭菌生理盐水的均质袋中拍击脱落，随后取1mL均质液逐级稀释，并按照文献[12]进行定量。此外，为了观测6与18 h后菌膜的形成情况，用结晶紫溶液处理载玻片上菌液30 min，洗去未结合的染料，再用95%的乙醇洗脱，并在显微镜下观测形态，6和18 h共重复试验5次。

1.7 灭菌方式

试验过程中，砧板、手、刀具和黄瓜需要达到无菌要求时，均采用相应的灭菌处理方式，具体见表1。

1.8 转移率的测定

应用Microsoft Excel 2013对实验数据进行统计，根据式(1)计算转移率，并采用SPSS18.0软件对不同组转移率进行显著性检验。

(1)

式中：T为转移率，N0为细菌供体表面带菌量(lg(N0/(CFU/g))或lg(N0/(CFU/cm2))),Nr为细菌受体表面带菌量(lg(Nr/(CFU/g))或lg(Nr/(CFU/cm2)))。

表1 各介质的灭菌方式Table 1 Sterilization methods of different items

2 结果与讨论

2.1 0 h切黄瓜操作中砧板单增李斯特菌的转移率

0 h切黄瓜操作中，卤猪舌、砧板和黄瓜中的菌量测定(以lg(CFU/g)计算)和转移率计算结果见表2。

由表2可知：场景1中，木质砧板与塑料、不锈钢砧板有显著性差异(P<0.05)，塑料和不锈钢砧板无显著性差异(P>0.05)；场景2中，木质砧板和塑料砧板有显著性差异(P<0.05)，不锈钢砧板与其他2种材质砧板并无显著性差异(P>0.05)；场景4中，木质和不锈钢砧板有显著性差异(P<0.05)，塑料砧板与其他2种材质砧板并无显著性差异(P>0.05)。砧板到黄瓜转移率的显著性分析显示，场景2中木质砧板和不锈钢砧板有显著性差异(P<0.05)，两者与塑料砧板无显著性差异(P>0.05)。可见，几乎每种场景下木质砧板都与其他2种材质砧板有显著性的差异。单增李斯特菌在木质砧板的转移率显著高于塑料砧板和不锈钢砧板的。

Table 2 Transfer rates ofL.monocytogenesin marinated pig tongue at different scenarios

场景lg(卤猪舌菌量/(CFU/g))lg(砧板菌量/(CFU/cm2))lg(黄瓜菌量/(CFU/g))卤猪舌到砧板转移率/%砧板到黄瓜转移率/%S1w478±027288±036260±0226034±656a914±1102S1p509±042431±053357±0438176±1517b8345±892S1s539±054412±030345±0697678±523b8341±1494S2w473±022269±032223±0375692±548a8338±1340aS2p509±041349±061226±0426956±1518b7678±1349abS2s538±051354±049246±0646598±808ab6896±1324bS3w469±019256±032161±0065449±5766426±1019S3p508±042229±069154±0284586±15477094±1590S3s538±051272±049187±0255078±10137032±975S4w472±021244±029152±0075172±499a6216±1051S4p507±044214±077126±0184285±1708ab6407±1523S4s537±052178±043107±0083358±985b6178±877

注：相同场景下同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

此外，同种材质砧板在场景1、2、3和4下呈现依次递减的趋势，场景1到场景2的递减程度较大。可见，对砧板不作任何处理，直接切取黄瓜，将会导致大量单增李斯特菌的转移和存活，造成交叉污染，此过程中单增李斯特菌的污染水平较高。对砧板进行细致的清洗处理，虽然不能完全杜绝卤猪舌中的单增李斯特菌通过砧板转移到黄瓜中，但是明显降低单增李斯特菌转移的数量。不同材质砧板在同种场景下，木质砧板到黄瓜的转移率较高，这表明，使用木质砧板处理食品导致交叉污染的风险是相对较高的。这可能是因为木质本身存在许多裂缝，容易让微生物存活和繁殖[15]。有研究表明，粗糙的受体表面有利于微生物的转移[16]，木质砧板相对于塑料和不锈钢砧板较粗糙，当接触黄瓜时，木质砧板能更多地转移单增李斯特菌。因而实际生活中要尽量避免使用木质砧板或进行彻底清洗。

2.2 6和18 h切黄瓜操作中单增李斯特菌膜形成情况

砧板静置18 h后切黄瓜的试验中，通过结晶紫染色与显微镜观测单增李斯特菌膜形成情况，结晶紫染色法只能观察到18 h时的菌落形态，未能观察到6 h时的，结果见图2。显微镜未能观察到6和18 h的单增李斯特菌膜形成,产生这种情况很可能是因为单增李斯特菌膜形成需要一定的时间，而本试验依据消费者行为习惯设定的时间间隔并不能达到菌膜形成所需时间。黄艳燕[17]对单增李斯特菌菌膜的测定是在培养了72 h后进行的，吴谦等[18]在玻璃表面培养副溶血性弧菌0、12、24、36和48 h后，得出0和12 h无明显的菌膜形成，24 h时的菌环明显增粗，相连的菌体数量明显增多，表明副溶血弧菌的生物膜已经成熟。本文结果与上述研究结果一致。这可证明菌膜的形成需要一定的时间，短时间内散状的菌落个体是无法繁殖成环状的菌膜结构的。

图2 18 h时3种材质砧板结晶紫染色法观测的菌落形态Fig.2 Observing colony morphology by crystalviolet staining on three different materialcutting boards at 18 h

在6与18 h切黄瓜操作中，4种场景下3种不同材质砧板到黄瓜的转移率见图3。

图3 4种场景下3种不同材质的砧板到黄瓜的转移率Fig.3 Transfer rates of 4 scenarios fromcutting boards to cucumber

由图3可知：处理完污染单增李斯特菌的卤猪舌后分别放置砧板6和18 h后再切黄瓜，4种场景下砧板到黄瓜的转移率变化趋势相似，即同种材质砧板场景1、2、3和4呈现依次递减的趋势；在不同材质砧板同种场景下，木质砧板到黄瓜的转移率较高，塑料和不锈钢砧板的转移率近似。与表2中0 h切黄瓜、砧板到黄瓜的转移率数据结果显示的趋势一致。

3 结论与展望

本研究着重于基础性试验，在国内外缺乏不同材质砧板处理生熟食品引发交叉污染相关研究的情况下，根据消费者生活习惯设定砧板放置时间0、6和18 h，按照文献调研结果设定场景，模拟厨房实际情况测定卤猪舌、砧板和黄瓜的污染水平并计算转移率。此外，对于不同材质的砧板进行比较，结果显示：4种场景下砧板到黄瓜的转移率变化趋势相似，即同种材质砧板在场景1、2、3和4下呈现依次递减的趋势；不同材质砧板在同种场景下，木质砧板到黄瓜的转移率较高，塑料和不锈钢砧板的转移率近似。而且，单增李斯特菌膜的形成需要一定的时间，短时间内无法形成环状菌膜。

本实验旨在通过食品加工环境对食源性致病菌的有效控制提供理论，为食品安全提供保障。虽然可以得出木质砧板在不清洗的情况下处理食品危害较大的结论，但未用一个公认的标准来衡量每种材质砧板在各个场景下的危害大小，缺乏一定的权威性。因此,后续研究可通过运用国际公认的危害水平标准来比较各材质砧板在各场景下危害大小且进行排序，更直观和有说服力。

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(责任编辑 管珺)

Effect of cutting board materials on transfer rate ofListeria monocytogenes from marinated pig tongue to cucumber

SONG Xiaoyu1,LU Ranran2,WANG Wen3,4,DONG Qingli2,LIU Qing2

(1.China National Center for Food Safety Risk Assessment,Beijing 100021,China; 2.School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China; 3. Hangzhou Center for Risk Assessment for Agricultural Products of the Ministry of Agriculture,Hangzhou 310021,China; 4. Institute of Quality Standards for Agricultural Products,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China)

The purpose of this work was to explore the influence of different cutting board materials on the transfer rate ofListeriamonocytogenesfrom marinated pig tongue to cucumber.The wooden cutting board,one plastic cutting board and one stainless steel cutting board were used.These cutting boards were stayed about 0,6 and 18 h according to the consumers′ habits.Meanwhile,transferring experiments were performed to mimic the food preparation process by setting four scenarios.And the contamination level (lg(CFU/g)) of marinated pig tongue,cutting boards and cucumber were also determined.At the same time,the biofilm formation on different material cutting boards was detected by crystal violet stain and microscope observation.The results showed that the scenario 1,2,3,4 descended orderly under the cutting board of same material,and the transfer rate of wood cutting board was significantly higher than that of the other two cutting boards under the same scenario.The transfer rate ofL.monocytogenesfrom plastic cutting board to cucumber was similar to those from plastic cutting board to stainless steel cutting board.In addition,biofilm ofL.monocytogeneswas not because the strain could not form a cyclic structure within the treatment of 6 and 18 h.

Listeriamonocytogenes; cutting board; cross-contamination; transfer rate; biofilm

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.001

2016-03-16

国家自然科学基金(31271896、31371776)；上海市科委长三角科技联合攻关领域项目(15395810900)；农业部农产品质量安全风险评估实验室(杭州)开放基金课题(2015FXPG01)；科技部“十二五”国家科技支撑计划(2015BAK36B04)

宋筱瑜(1982—)，女，山东济南人，博士，副研究员，研究方向：食品微生物风险评估；董庆利(联系人)，副教授，E-mail:dongqingli@126.com

TS251.6

A

1672-3678(2016)06-0001-06