金针菇中单增李斯特菌生长预测模型的建立

赵 新，王 永，刘 娜，陈 锐，朱 珠，王 成，兰青阔

(天津市农业质量标准与检测技术研究所农业部农产品质量安全风险评估实验室(天津)，天津300381)

金针菇中单增李斯特菌生长预测模型的建立

赵 新，王 永，刘 娜，陈 锐，朱 珠，王 成，兰青阔

(天津市农业质量标准与检测技术研究所农业部农产品质量安全风险评估实验室(天津)，天津300381)

为建立不同温度条件下金针菇中单增李斯特菌的生长模型，将单增李斯特菌接种到金针菇表面，并于不同温度下贮藏，获得其在10、l5、20、25和35 ℃下的生长数据，选用Baranyi模型进行拟合，建立初级生长模型，并拟合得到最大比生长速率。通过温度对初级模型中最大比生长速率的生长动力学拟合，分别建立Ratkowsky、Huang rate、Cardinal和Arrhenius-type二级生长模型，并进行数学检验。结果表明：Arrhenius-type模型呈现良好的线性关系，且评价结果优于其他模型，可作为次级模型对不同温度下金针菇中单增李斯特茵的生长动态进行预测。

金针菇；单增李斯特菌；生长模型；预测微生物

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是近年来报道较多、关注度较高、危害性较大的食源性病原菌之一。该菌属人畜共患菌，分布较广，一旦感染，致死率高达20%～30%[1]。该菌耐低温，在4 ℃条件下仍能生长繁殖，是冷藏食品中危害人类健康的食源性病原菌之一[2-3]，连续10年被美国疾病预防控制中心(CDC)作为导致食源性疾病爆发的6类病原微生物监测对象之一。由金针菇中感染单增李斯特菌而导致的食源性疾病暴发事件在美国、韩国等地屡有报道，我国近几年对不同地区各类食品的风险监测中，金针菇中单增李斯特菌检出率也逐年升高。单增李斯特菌虽对热的抵抗力较弱，但仍需60 ℃、30 min方可灭活[4]，因此，如果消费者对金针菇的食用方式不恰当，则存在一定的风险。

预测微生物学是数量化描述微生物的新兴学科，它可对食品的货架期做出合理预测，准确估算商品的剩余货架期，从而成为监测储藏、流通和零售过程安全性评估的有效手段[5]。预测模型可定量或半定量的描述在特定环境条件下食源性病原菌的生长、残存和死亡动态，由此确保食品在生产、加工、运输、销售和贮藏等一系列环节的安全和品质[6-7]。近年来，国内有很多关于食品中微生物预测模型的报道，例如营养肉汤[8]、猪肉[9]、洋白菜[10]和莴苣[1]中单增李斯特菌的生长模型，牛肉和猪肉[11]中大肠杆菌的生长模型，在冷鲜猪排骨[5]中假单胞菌的生长模型及冷却猪肉中的气单胞菌生长预测模型[12]等，但研究范围局限，至今仍处于发展的初级阶段。IPMP(Intergrated Precffctive Modeling Program)是由美国农业部微生物食品安全研究机构开发的开放性工具软件，包括11种微生物的35种模型，能够针对致病菌的生长或失活进行预测；同时ComBase数据库也是一个很好的开放性网络平台，由成千上万的微生物生长和存活率曲线组成，提供了19种食品、29种微生物和5种环境因素的模型选择[13]，都可以很好地弥补研究人员在数学和统计学上的不足，为预测微生物学的发展和深入研究提供了很好的辅助工具。

为了能够将已知风险降低在可控范围内，本研究拟建立单增李斯特菌生长预测模型，通过IPMP软件，对不同温度下该菌在金针菇中的生长、残存和死亡情况进行拟合，旨在较为科学地预测该菌在金针菇中的存活情况，为金针菇的安全监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与菌株

金针菇购于天津市华苑附近农贸市场，紫外线下灭菌30 min后，无菌分装10 g每份于无菌袋中，置于冰箱中备用，同时进行本底检测。单核增生李斯特氏菌CMCC(B)54002，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 培养基与仪器设备

PALCAM颗粒型琼脂培养基、营养肉汤、缓冲蛋白胨水(BPW)培养基和生化鉴定试剂盒，北京陆桥技术有限责任公司；法国科玛嘉李斯特氏菌显色培养基，郑州博赛生物科技有限公司。

拍击式均质器，上海之信仪器有限公司；全自动高压灭菌锅，日本三洋有限公司；电热恒温培养箱，上海一恒有限公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；OLYMPUS CX31型显微镜，日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 金针菇样品本底检测

将紫外线下灭菌30 min的10 g金针菇样品加入90 mL缓冲蛋白胨水中，拍击式均质器均质1 min，取0.1 mL涂布于PALCAM琼脂平板表面，36 ℃培养48 h，进行本底检测，本底带菌量不得大于103CFU/mL。

1.3.2 接种液的制备

取单增李斯特菌保藏磁珠进行菌株活化，对活化后的菌液进行PALCAM平板计数，得到活化后密度为104CFU/mL的单增李斯特菌菌液，备用。

1.3.3 金针菇样品模拟添加试验

将1 mL密度为104CFU/mL的单增李斯特菌菌液接种至10 g经紫外线下灭菌的金针菇中，尽量使其均匀饱和吸收，将初始感染浓度为103CFU/g的金针菇样品，模拟不同温度(10、15、20、25和35 ℃)进行恒温培养，每隔一段时间，取出样品，放入90 mL缓冲蛋白胨水中，拍击式均质器均质1 min，用移液器取0.1 mL稀释液涂布于PALCAM琼脂平板，于36 ℃倒置培养48 h后，进行菌落计数。

1.3.4 初级预测模型的建立

应用USDA Integrated Predictive Modeling Program (IPMP)工具中Full Growth Models中的Huang模型、Baranyi模型、Gompertz模型分别对试验数据进行生长曲线的拟合，建立初级模型，获得最大比生长速率。对不同模型SSE、MSE、RMSE、AIC等相关参数进行比较，确定最适初级预测模型。Baranyi Model的表达式为

Y(t)=Y0+μmaxA(t)-

(1)

exp(-h0)-exp(-μmaxt-h0)]

(2)

式中：t为时间，h；Y(t)为t时的菌数，CFU/g；Y0为初始菌数，CFU/g；Ymax为最大菌数，CFU/g；μmax为最大比生长速率，h-1；h0为模型的参数。

1.3.5 二级模型的建立与评价

应用IPMP工具中Secondary models-Temperature effect中的Ratkowsky(3)、Huang rate(4)、Cardinal(5)和Arrhenius-type(6)这4个模型，拟合金针菇中单增李斯特菌最大比生长速率与温度的函数关系，建立二级模型，并通过误差平方和(SSE)，均方误差(MSE)，均方根误差/标准误差(RMSE)，残留标准偏差Residual stdev等模型参数进行拟合度的比较，对所建立模型进行评价。模型表达式如下

(3)

(4)

μmax=

(5)

(6)

式中：μ为比生长速率，h-1；T为特定生长温度，℃；T0为最低生长温度，℃；Tmin为最低生长温度，℃；μmax为最大比生长速率，h-1；Tmin和Tmax分别为最低生长温度和最高生长温度，℃；μopt为最适温度Topt下的生长速率，lg(CFU/g)；R为气体常数(8.134 J/mol)；△G′为与细菌生长有关的一种动能；a和n为模型的参数。

2 结果与讨论

2.1 初级预测模型的建立

根据10、15、20、25和35 ℃下单增李斯特菌在金针菇中生长试验的观察值，选用Huang模型、Baranyi模型、Gompertz模型分别描述单增李斯特菌在金针菇中的生长动态。通过不同模型SSE、MSE、RMSE和AIC等相关参数的比较，结果如表1所示。由表1可以确定最适初级预测模型为Baranyi模型。

表1 不同模型相关参数的比较Table 1 Comparison of different model parameters

SSE、MSE、RMSE和AIC是对方程的错误分析，参数值越小表明方程描述单增李斯特菌的生长动态误差越小。AIC代表Akaike准则。通过分析最终确定以Baranyi模型作为单增李斯特菌在金针菇中生长的初级预测模型。金针菇中单增李斯特菌的初始带菌量为103CFU/mL。将10、15、20、25和35 ℃条件下测定的金针菇中单增李斯特菌的生长数据，选用Baranyi模型进行拟合，所得的生长曲线如图1所示。

由图1可知：在10 ℃时，单增李斯特菌的生长比较缓慢，延至期时间较长；随着温度的升高，单增李斯特菌的生长逐渐加快，延至期时间明显缩短，最大比生长速率逐渐增加，具体数值见表2。

2.2 二级模型的建立与评价

应用Ratkowsky、Huang rate、Cardinal和Arrhenius-type这4个模型，将表2中得到的最大比生长速率与温度这一环境条件进行拟合，拟合结果见图2、表3。由图2和表3可知，在对最大比生长速率的拟合方面，Arrhenius-type模型的SSE、MSE、RMSE和Residual stdev(残留标准偏差)均为4个模型中最小参数值，参数值越小表明方程描述单增李斯特菌的生长动态误差越小，方程的拟合度越好。

Ratkowsky模型、Huang rate模型、Cardinal模型和Arrhenius-type模型的预测值和Baranyi模型的观测值见表4，预测值和观测值之间的拟合程度分别用A、B、C和D表示(A、B、C和D分别表示二者差异绝对值由小到大)。由表4可知：除10和35 ℃外，Arrhenius-type模型对单增李斯特菌在金针菇中的拟合效果最佳，预测值与观测值之间存在的差异均为最小，标记为A。在10 ℃条件下，Cardinal和Huang rate模型的拟合效果较好，Arrhenius-type模型拟合度绝对值偏差次之，标记为B；在35 ℃条件下，Cardinal模型的拟合效果较好，Arrhenius-type模型拟合度绝对值偏差次之，标记为C，但综合所有温度数据显示，依然是Arrhenius-type模型的拟合效果最佳，因此确定Arrhenius-type模型为单增李斯特菌在金针菇中的二级生长预测模型。

图1 Baranyi模型拟合的不同温度条件下测定的金针菇中单增李斯特菌的生长数据Fig.1 Growth data of L. monocytogenes in needle mushroom fitted of Baranyi model at different temperatures表2 不同温度下单增李斯特菌的最大比生长速率和延滞期Table 2 Maximum growth rate and lag ofL. monocytogenes at different temperatures

温度/℃最大比生长速率/h-1生长延滞期/h100033383911500814304200222352825032336013504142461

图2 不同温度条件下单增李斯特菌的最大比生长速率拟合的模型Fig.2 Maximum specific growth rate fitting model at different temperature conditions of L.monocytogenes表3 不同模型相关参数的比较Table 3 The comparison of different model parameters

模型SSEMSERMSEResidualstdevRatkowsky0005000200390030Huangrate0004000100370028Cardinal0001000100240011Arrhenius⁃type0001000000170010

图3反映了二级模型的预测值与观察值之间的显著性差异。由图3可知：Arrhenius-type模型拟合的预测值与Baranyi模型得到的观测值拟合程度最为接近，表明Arrhenius-type模型可很好的描述单增李斯特菌在金针菇中的生长动态，为最佳次级模型。

二级模型建立后，对其可靠性进行分析是模型建立过程中重要环节之一，目前常用的方法有参数误差分析和图像分析。参数误差分析是通过拟合软件中生成的相关参数误差数据，进行罗列和比较，参数误差值越小表明模型的拟合效果越好。图像分析[14]是通过用图表示预测值与观测值散点之间的拟合度绝对值偏差，偏差越小表明拟合程度越好。通过Ratkowsky模型、Huang rate模型、Cardinal模型、Arrhenius-type模型的预测值和Baranyi模型的观测值之间的拟合度绝对值偏差分析，Arrhenius-type模型的预测值除10 ℃外几乎全部与Baranyi模型观测值散点重合，体现了Arrhenius-type模型的预测值能够很好地吻合观测值。

综合图3结果及SSE、MSE、RMSE和Residual stdev等相关参数的误差分析，可以直观地评价Arrhenius-type模型的拟合效果较好，说明所建立的模型能够较为准确地预测单增李斯特菌在金针菇中的生长状况。

表4 不同温度条件下单增李斯特菌的观测值和预测值Table 4 Observed and predicted values of L.monocytogenes at different temperatures conditions

注：不同的大写字母表示预测值与观测值之间存在的差异绝对值。

图3 二级模型的预测值与观察值之间的显著性差异Fig.3 Significantly differents of observed valuesand predicted values of secondary model

3 结论

金针菇作为中国居民较为喜爱的食品之一，在国内研究还相对较少，为探讨单增李斯特菌在金针菇生产、运输和贮藏过程中的消长规律，通过IPMP开放软件，对不同温度下单增李斯特菌在金针菇中的生长、残存和死亡情况进行拟合。首先确定最适初级预测模型为Baranyi模型，然后应用Ratkowsky、Huang rate、Cardinal和Arrhenius-type这4个模型，通过温度对初级模型中最大比生长速率的生长动力学拟合，确定Arrhenius-type模型为单增李斯特菌在金针菇中的二级生长预测模型，该模型能够较为准确地预测单增李斯特菌在金针菇中的生长状况。本研究对单增李斯特菌的存活情况做出较为科学的预测，为监控金针菇的食品安全和风险评估提供科学依据。

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(责任编辑 管珺)

Establishment of Listeria monocytogenes growth predictive modelesin edible mushroom Flammulina velutipes

ZHAO Xin,WANG Yong,LIU Na,CHEN Rui,ZHU Zhu,WANG Cheng,LAN Qingkuo

(Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-Products (Tianjin) of the Ministry of Agriculture,Tianjin Institute of Agricultural Quality Standard and Testing Technology,Tianjin 300381,China)

We established a growth model ofListeriamonocytogenesin edible mushroomFlammulinavelutipesat different temperature.Listeriamonocytogeneswas inoculated to the mushroom to obtain growth data at 10,15,20,25 and 35 ℃.Baranyi model was fitted with the primary growth model to get the maximum specific growth rate.By fitting temperature to the maximum specific growth rate kinetics in the primary model,we established Ratkowsky,Huang rate,Cardinal and Arrhenius-type model.The Arrhenius-type model can be used as a secondary model at different temperatures for the growth ofListeriamonocytogenesin the mushroom，with a good linear relationship,and the prediction results were better than the other models.

needle mushroom;Listeriamonocytogenes; growth model; predictive microbiology

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.003

2016-03-01

2016年国家食用菌风险评估项目(GJFP201600602)；2016年国家农产品病原微生物风险评估项目(GJFP201601302)

赵 新(1983—)，女，北京人，助理研究员，研究方向：农产品病原微生物分子检测技术；兰青阔(联系人)，副研究员，E-mail：lanqingkuo@126.com

TS251.5

A

1672-3678(2016)06-0012-06