蛋黄液中沙门氏菌温度预测模型的建立

韩梦琪，孙 卓，金永国，马美湖

(华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070)

蛋黄液中沙门氏菌温度预测模型的建立

韩梦琪，孙 卓，金永国，马美湖

(华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070)

为探究温度对沙门氏菌在蛋液中生长规律的影响，测定了在4、10、15、20、25、30、37和42 ℃等不同温度下沙门氏菌的生长曲线，利用Origin 8.0软件中非线性最小二乘法的原理进行修正Gompertz方程、修正Logistic方程的拟合以及DMFit软件进行Baranyi模型的拟合，研究结果表明修正Gompertz模型、修正Logistic模型和Baranyi模型均能得到较高的决定系数(>0.99)，选取决定系数相对较高的修正Logistic模型进行一级模型的建立。通过参数估计后利用Ratkowsky模型对最大比生长速率以及迟滞期进行二级模型的拟合，通过Baranyi模型得到的生长参数建立的二级模型拟合度高于其他模型，最大比生长速率以及迟滞期二级模型决定系数分别为0.978和0.866。经检验，研究建立的模型可用于10～42 ℃温度范围内蛋黄液中沙门氏菌的生长预测。

蛋黄液；沙门氏菌；预测模型

在我国细菌性食物中毒中，70%～80%的案例是由沙门氏菌引起，我国风险监测显示：蛋及蛋制品中沙门氏菌的检出率为3.9%～43.7%[1]。沙门氏菌为革兰氏阴性菌，形态呈两端钝圆的短杆菌，目前研究中分离得到的沙门氏菌有2 500余种血清型，其中与人类疾病有关的常见血清型为鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌以及肠炎沙门氏菌[2]。

利用预测微生物学的原理，根据主要的环境因子例如温度、水分活度、pH等对微生物致病菌以及腐败菌在生长中的影响建立一系列模型，应用这些预测模型可以快速有效地对微生物的生长、存活和死亡进行预测[3]，为微生物定量风险评估(QMRA)和危害分析关键控制点(HACCP)以及食品货架期预测提供科学的依据，从而确保食品在生产、加工和流通等过程中的安全。随着预测微生物学在20世纪90年代的迅猛发展以及沙门氏菌污染在食源性疾病案例的频繁出现，针对沙门氏菌的预测模型研究涉及的食物种类繁多，其中包括肉类与肉制品、蛋与蛋制品、蔬菜和熟食等。

蛋类及其制品感染或污染沙门氏菌的风险较大，带菌率可高达30%～40%[4]。蛋液的生产中易受到沙门氏菌感染，蛋清中沙门氏菌的生长被其中的溶菌酶等抗菌物质抑制到最低程度[5]，而蛋黄中鲜有报道对沙门氏菌有抑制作用的物质，所以沙门氏菌在蛋黄内易生长并大量繁殖，研究不同温度下蛋黄液中沙门氏菌的生长规律并建立预测模型具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

沙门氏菌(SJTUF10984、SJTUF10978和ATCC13076)；菌株分离自受污染的蛋液产品中，SJTUF10984与SJTUF10978为肠炎沙门氏菌，ATCC13076为沙门氏菌标准菌株。以上菌株均贮存于-80 ℃、20%甘油中。菌株接种于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中，37 ℃培养箱中培养16～24 h，活化三代备用。

新鲜鸡蛋，海兰褐品种(产蛋时间<48 h)，购买自湖北省武汉市九峰山养鸡场。

木糖赖氨酸去氧胆酸(XLD)培养基，北京陆桥技术有限责任公司；TSB培养基，青岛海博公司。培养基的配制方法参照厂家说明书。

1.2 仪器

YM75型立式电热蒸汽消毒器，上海三申医疗器械有限公司；ZHWY-2102C型立式双层恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；SW-CJ-2D型超净工作台，苏州净化设备有限公司；高速台式离心机，德国SIGMA公司；SPX-250BS-1型生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；AR2140型分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；1 mL、200 μL移液枪，德国Eppendorf公司；FE20型pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；RW20型电动搅拌机，德国IKA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌悬液的制备

将沙门氏菌划线至XLD平板，挑取黑心有光泽的典型菌落接种至无菌TSB液体培养基中，37 ℃下培养16～24 h，将3个菌种的菌液通过涡旋振荡器充分混合，通过磷酸盐缓冲液(PBS)稀释104倍，得到最终混合菌种的菌悬液。

1.3.2 蛋黄液的制备

将鸡蛋在流水下洗净，待干后再用75%乙醇棉消毒蛋壳，并在紫外灯下照射15 min，以无菌操作打开蛋壳取出蛋液，用消过毒的分蛋器使蛋黄与蛋清分离，将蛋黄放入带有玻璃珠的灭菌瓶内，充分摇匀并搅拌待用。

1.3.3 样品接种

将准备好的蛋黄液以10 g每份的量分装至50 mL无菌离心管中，置于恒温(4、10、15、20、25、30、37和42 ℃)生化培养箱中，使其与培养箱温度达到平衡，1 h后取出准备接种。向每个加入10 g蛋黄液的离心管中加入200 μL接种菌液，使得初始接种浓度在1.5×104～1.5×105CFU/g。将接种后的样品管与对照管置于恒温培养箱中培养。

1.3.4 沙门氏菌计数

采取XLD琼脂培养基对沙门氏菌进行平板计数。在本研究的8个实验组中，在30、37和42 ℃条件下每隔2 h计数一次，在20、25 ℃时每隔5 h计数一次，在10、15 ℃条件下每隔12 h计数一次，在4 ℃条件下每隔24 h计数一次。每个实验组重复2次。

1.3.5 生长模型的建立

分别采用修正Gompertz方程、修正Logistic方程以及Baranyi方程进行沙门氏菌生长曲线的拟合，估算生长曲线的最大比生长速率(growth rate,μmax)以及迟滞期(lag time，λ)。修正Gompertz方程、修正Logistic方程应用美国OringinLab公司开发的OringinPro for Windows(V7.5)软件中的Levenberg-Marquardt法(非线性最小二乘法)进行拟合，修正Gompertz方程为

(1)

式中：A是初始菌对数浓度N0，C是初始菌浓度和最大菌浓度的差值，M是生长速率达到最大的时间，B是M时相对最大生长速率。转化成生物学意义方程为[6]

(2)

修正Logistic方程为

(3)

转化成生物学意义方程为[6]

(4)

Baranyi方程应用英国食品研究中心(Institute of Food Reasearch,IFR)开发的DMFit v2.0 软件，软件依据的方程为

(5)

(6)

(7)

式中：Y0和Ym分别是最初菌对数浓度和最终菌对数浓度，μmax是最大比生长速率(h-1)，λ是迟滞期(h)。

一级模型的校验利用决定系数R2进行评价。二级模型采取由Belehradek创立，Ratkowsky等改进的平方根模型：

(8)

(9)

式中：T是摄氏温度(℃)，Tmin假设了微生物没有代谢活动时的温度，b值为常数。

1.3.6 模型评价

一级模型的决定系数采用决定系数R2评价生长参数的评估采用SPSS软件进行分析，二级模型采用残差平方和(RSS)，平方根误差(RMSE)、偏差因子(Bf)和准确性因子(Af)来评定，表达式如下：

RSS=∑(obs-pred)2

(10)

(11)

(12)

(13)

式中：obs为用一级模型拟合中的3种方程拟合的蛋液中沙门氏菌生长曲线的生长参数μmax或λ的观测值，pred为用建立的沙门氏菌在蛋液中的生长模型的预测值。

2 结果与讨论

2.1 一级模型的拟合

在实验选取的温度范围中对模型进行拟合，结果见表1和图1。由表1可知：在4 ℃条件下的生长曲线无法使用3种模型对其进行拟合，沙门氏菌数未观测到显著的生长现象，且在培养96 h后，沙门氏菌数呈现失活趋势，由线性回归分析可得失活曲线斜率在0.001 8左右。由图1可知：在10、15、20、25、30、37和42 ℃条件下，沙门氏菌在蛋黄液中的生长曲线均能和研究中选取的3种模型较好地拟合(R2>0.971)，呈现较为显著的“三段式”S型生长曲线。由表1可知：修正Gompertz方程、修正Logistic方程和Baranyi模型平均决定系数分别为0.992、0.995和0.993，决定系数值比较接近，修正Logistic方程进行一级拟合的R2值最高。对Nt绘制相对时间(t)的曲线图，图1中的曲线由修正Logistic模型拟合而得。相同温度下决定系数在各个模型拟合结果之间的差异，而温度不同决定系数在模型内也呈现差异，例如在37、10℃条件下各个模型的决定系数均较低。

2.2 生长参数与二级模型

Baranyi模型通过DMFit软件拟合得到生长参数μmax、λ及统计分析后，结果如表2所示。由表2可知：在试验温度范围内，温度的升高使μmax逐渐增大，而迟滞期结果在37 ℃条件以外的其他温度条件下，随着温度升高呈缩短趋势变化。修正Gompertz方程、修正Logistic方程和Baranyi模型拟合一级模型之后分别得到相应的最大比生长速率值以及迟滞期值，将拟合得到的μmax进行比较分析，分别代入到Ratkowsky方程中进行线性回归分析，决定系数均大于0.97，将拟合得到的λ值进行比较分析，Barayi模型与修正Gompertz方程决定系数能达到0.89以上。结合2次拟合的决定系数比较，选用Baranyi模型拟合的一级模型得到的最大比生长速率值以及迟滞期值进行沙门氏菌在蛋黄液中温度二级模型建立，二级模型拟合结果如图2所示，得到的Ratkowsky模型见式(14)～(15)。

表1 修正Gompertz方程、修正Logistic方程参数及统计分析Table 1 Statistic analysis of growth parameters of modified Gompertz function and modified Logistic function

图1 不同温度条件下沙门氏菌在蛋黄液中一级模型的建立Fig.1 Primary growth model of Salmonella in egg yolk at different temperature

(14)

(15)

表2 应用Baranyi模型拟合求得不同温度下的 沙门氏菌生长曲线的生长参数Table 2 Parameters growth rate and lag time of Salmonellabacteria obtained from Baranyi model

图2 不同温度下沙门氏菌在蛋液中的二级生长模型Fig.2 Secondary models of Samonella atdifferent temperature

模型采用残差平方和(RSS)、平方根误差(RMSE)、偏差因子(Bf)和准确性因子(Af)的评定结果，见表3、4。

根据病原菌Bf值的划分标准来说，0.9

表3 最大比生长速率(μmax)的预测值与实际值统计学分析Table 3 Statistics analysis of μmax between predicted value and observed value

表4 迟滞期(λ)的预测值与实际值统计学分析Table 4 Statistics analysis of λ between predicted value and observed value

实验中研究了蛋黄液在生产加工和流通中波动最大的因素——温度变化下生长的规律，选取冷藏温度4 ℃以及10～42 ℃的温度范围内的条件建立了相应的一级模型和二级模型。在10、15、20、25、30、37和42 ℃条件下，用修正Gompertz方程、修正Logistic方程和Baranyi模型拟合得到的一级模型的决定系数R2>0.97，均能较为准确的预测相应温度条件下沙门氏菌在蛋黄液中的生长，但修正Logistic方程决定系数相对较高。Szczawinska等[7]在熟火腿中以及Sakha等[8]在杀菌液全蛋与未杀菌液全蛋中建立的沙门氏菌温度模型有相同结果。与之相反，Juneja等[9]等在鸡肉的研究中、国内学者在草鱼鱼糜中[10]、杀菌液全蛋[11]以及冷却牛肉中[12]建立的沙门氏菌温度生长模型以及冷却猪肉[13]中建立气单胞菌温度生长模型，都发现修正Gompertz方程的拟合度更高。修正Logisti方程与修正Gompertz方程均是较为常用的经验模型，而Baranyi模型是真正意义上的动力学模型[14]。高丽娟等[15]在新鲜猪肉滤汁中用Baranyi模型与Ratkowsky模型建立了较为准确的一级和二级模型。而本研究的结果发现：仅从拟合度上来说，沙门氏菌的一级生长模型在应用修正Gompertz模型、Logistic模型和Baranyi模型拟合时差别并不大，但采用Ratkowsky模型进行二级模型的拟合时，Baranyi模型估计的参数更适用于二级模型的建立，在Juneja等[16]在牛肉中建立的沙门氏菌温度模型也证实Baranyi模型更适用于一级模型与二级模型结合的整体研究中。

实验结果显示：在4 ℃条件下，沙门氏菌在蛋黄液中无法生长，但失活速率较小(k<0.001 8)，且由本文建立的二级模型可推知，沙门氏菌在蛋黄液中的没有代谢活动的温度Tmin在-0.62～0.53，虽然这只是理论模型的推测，实际在4 ℃条件下已观察不到生长现象，但是这证实研究中的生长速率二级模型在10 ℃以下的低温环境中并不能适用。在10～42 ℃的范围内，所得到的生长速率二级模型还是可以预测沙门氏菌在蛋黄液中的实际生长速率值，虽然本研究所建立模型所得预测值相对实际值略有偏高，但是这有利于其在实际的风险评估与食品管理中应用的安全性[15]。本文对迟滞期的预测准确性比对生长速率的预测准确性要低，迟滞期的预测不够准确主要是实验过程中无法保证沙门氏菌接种状态完全相同而导致的系统误差所致。

3 结论

笔者所建立的沙门氏菌的温度预测模型可以可靠地预测沙门氏菌在10～42 ℃的温度范围内在蛋黄液中的生长情况，影响沙门氏菌生长的因素还有水分活度、盐度和pH等因素，温度是主要的影响因素之一。通过研究不同温度条件下蛋黄液中沙门氏菌的生长模型，可以为蛋黄液中沙门氏菌污染的预测和监控提供有效的工具，以提高产品的安全性，下一步可探究盐度等其他蛋黄中变化较大的因素来进行模型建立，更加完善沙门氏菌在蛋黄液中的预测模型研究。

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(责任编辑 管珺)

Development of a predictive model for Salmonella in egg yolk atdiferrent temperatures

HAN Mengqi,SUN Zhuo,JIN Yongguo,MA Meihu

(College of Food Science & Technology，Huazhong Agriculture University，Wuhan 430070,China)

To study the growth ofSalmonellain the egg yolk, we measured growth curves at different temperatures (10,15,20,25,30,37 and 42 ℃).The modified Gompertz function and The modified Logistic function were applied to fit the growth curves by the method of Levenberg-Marquardt in Origin 8.0 software. The Baranyi model was applied to fit the growth curves by DMFit software.All the models were fitted to each individual growth curve satisfactorily with a highR2>0.99,then the primary model was established by the Logistic function with a higherR2.Ratkowsky model was used to fit the maximum specific growth rates and the lag time obtained by parameter estimation for the establishment of the secondary model.The growth parameters obtained from the Baranyi model were accurate and useful in fitting growth curves than other models. The secondary model had better fit withR2of 0.982 for the growth rate and 0.892 for the lag time.We developed primary and secondary models to predictSalmonellagrowth in egg yolk between 10 and 42 ℃.

egg yolk;Salmonella;predictive model

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.006

2016-03-07

国家自然科学基金(31230058)；现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-41-K23)

韩梦琪(1992—)，女，湖北宜昌人，研究方向：禽蛋蛋白质抗菌机制；金永国(联系人)，副教授，E-mail：jinyongguo@mail.hzau.edu.cn

TS201.3

A

1672-3678(2016)06-0029-06