陕县温泉嗜热菌分离与初步鉴定

◎张 晶

（三门峡职业技术学院食品园林学院，河南三门峡，4 7 2 0 0 0）

陕县温泉嗜热菌分离与初步鉴定

◎张 晶

（三门峡职业技术学院食品园林学院，河南三门峡，4 7 2 0 0 0）

从陕县温泉水样中分离纯化出一株高温菌W1，并对其生理生化特征进行鉴定。结果表明：菌株W1为革兰氏阳性杆菌，最适生长温度65℃，最适pH为8，能够利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖，淀粉水解、明胶水解、甲基红实验及葡萄糖发酵实验结果均为阳性；吲哚反应、VP反应和H2S反应结果均为阴性；初步鉴定为嗜热脂肪地芽孢杆菌属。

温泉；嗜热菌；生理生化特征

温泉是指水温超过摄氏20℃的泉水，作为独特的自然资源，其开发利用得到了高度重视[1]。陕县位于三门峡市区西15公里处，区内大营镇温塘有温泉出露，该温泉位于汾渭热矿水带弧形转折处和山西裂谷边缘基地，属低矿化度淡温泉，水温适宜，富含偏硅酸、锶、锂、碘、硒、铁等34种有益人体健康的微量元素和其他成分，是全国少有的优质矿泉水。嗜热菌是一类能在45℃以上生长和繁殖的极端环境微生物，在食品[2]、工业[3]、生物浸矿、石油及煤炭的脱硫、发酵生产、污水处理等领域有广泛应用。[4-5]

目前关于陕县温泉的研究主要集中在温泉地质和温泉旅游开发两个方面，针对陕县温泉微生物资源的研究尚未见报道，微生物是重要的分解代谢类群，其生物多样性在维持生物圈和为人类提供广泛而大量的未开发资源方面起着主要的作用[6]。因此，本研究对陕县温泉微生物的组成进行分析，并对其中的嗜热微生物进行分离、筛选及理化鉴定，为陕县温泉微生物资源的开发和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

温泉水样采集自陕县温塘村（111.10942E,34.71626N），泉水无色，温度57℃，pH7.2，水样采集方法主要参照《中华人民共和国地表水环境质量标准》进行，取纯水样1000ml，置于保冷袋中运输至实验室分离。

1.2 嗜热菌分离

取100ml水样于5000r/min高速离心机中离心20分钟，弃上清，将沉淀重悬于10ml无菌蒸馏水中，充分混匀备用。于无菌条件下采用平板涂布法对温泉嗜热菌进行分离，60℃培养箱中培养24-72h。挑取单菌落平板划线分离，直至分离出纯菌种。

1.3 培养基

脑心浸出液肉汤培养基（BHI分离细菌）[7]：蛋白胨10g，脱水小牛脑浸粉12.5g，脱水牛心浸粉5g，葡萄糖2g，氯化钠5g，磷酸氢二钠2.5g，蒸馏水1000ml，pH7.2-7.6，115℃高压灭菌20分钟，备用。

高氏一号培养基（分离放线菌）：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2-7.4，配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，便搅拌边加入其他成分，融化后，补足水分至1000ml，121℃灭菌20分钟；

马丁氏琼脂培养基（分离真菌）：葡萄糖10g，蛋白胨5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，1/3000孟加拉红100ml，琼脂15-20g，蒸馏水800ml，121℃灭菌30分钟；临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。

1.4 嗜热菌培养条件优化

挑取斜面纯菌种接种于50ml液体BHI摇瓶中，60℃培养18h，使OD600达到1.0。取上述菌液2ml转入100ml新鲜液体BHI摇瓶，实验过程中分别设置系列温度（50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）和pH（5、6、7、8、9）梯度，180r/min振荡培养24-28h，测定OD600值，确定所分离嗜热菌的最适培养温度和pH。

1.5 嗜热菌生理生化鉴定

参照相关文献[8]及《伯杰细菌鉴定手册》对所分离嗜热菌的形态及生理生化性能进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 温泉微生物群落结构分析

样品经富集处理后，采用平板菌落培养法对温泉样品微生物群落结构组成进行分析，结果如表1所示。

陕县温泉可培养微生物总数在103cfu/ml，微生物群落结构组成中，细菌占绝对优势，可培养数目达到5×103cfu/ml，放线菌数目为70cfu/ml，实验过程中虽经过三次重复检测，但马丁氏培养基上均没有菌落生长，未检测到真菌。

陕县温泉泉水无色，温度57℃，pH7.2，地热埋藏较浅，成因属隆起断裂型，主要化学成分为H2CO3· S04-Ca[9,10]。于新娟[6]等研究表明，温泉微生物多样性与地理位置、温度、酸碱度和水化学成分相关。

2.2 嗜热菌菌体形态

根据平板数量优势，从温塘温泉水样中分离得到一株嗜热菌W1，形态见图1，平板菌落近圆形，直径0.7-1cm，边缘整齐，亮黄色，光滑潮湿，不透明。显微镜染色结果如图1B所示，菌体呈短杆状，革兰氏染色阳性。

2.3 嗜热菌最适生长温度

嗜热菌W1自然生长环境温度为57℃，因此实验设计以60℃为起点，上下浮动10℃，每5℃设置一个温度梯度，共五个试验温度。

如图2所示，温度对嗜热菌生长影响明显，培养前15h，菌体在各温度下均生长迅速，15h后除70℃下菌体生长受到抑制外，其他温度下菌体密度随温度升高增加，培养超过25h后，菌体浓度均出现下滑趋势，由菌体生长曲线可知嗜热菌W1在65℃下有最大生长量，因此W1的最适生长温度为65℃。

表1 温泉微生物群落结构组成（cfu/ml）

图1 嗜热菌W1菌落形态（A）及菌体形态（B）图

2.4 嗜热菌最适pH

嗜热菌W1自然生长环境pH值为7.2，因此实验设计以pH7为起点，上下浮动2个单位，每1个pH值下设置一个监测点，共五个pH梯度。

pH对嗜热菌生长影响如图3所示，培养前25h，初始pH低于5或高于9时，菌体生长缓慢，其他pH下菌体密度随pH升高而显著增长，培养超过25h后，菌体浓度均出现下滑，由菌体生长曲线可知嗜热菌W1的最适生长pH为8。

2.5 嗜热菌生理生化特征

为进一步了解嗜热菌W1的生物学分类地位，根据《伯杰细菌鉴定手册》鉴定项目进行相关生理生化特征鉴定，结果如表2所示。

由表2可知，所分离嗜热菌W1能够利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖，碳源利用形式多样，适应能力较强；淀粉水解、明胶水解、甲基红实验及葡萄糖发酵实验结果均为阳性；吲哚反应、VP反应和H2S反应结果均为阴性；

结合平板菌落形态及显微镜镜检结果，初步判定所分离嗜热菌W1为嗜热脂肪地芽孢杆菌属。

刘景圣[2]，吴红萍[3]，万滋衡[11]等分别从长白山温泉、海南蓝洋温泉和湖北咸宁温泉中分离到嗜热菌，经理化鉴定及分子生物学鉴定，所分离菌株均为芽孢杆菌属微生物，此外李聪颖[12]、李杨霞[13]等学者也从相关研究中分离到芽孢杆菌嗜热菌。可见温泉样品中蕴含着丰富的芽孢杆菌资源。

目前嗜热脂肪芽孢杆菌在食品、酶制剂等领域有较高的应用，杨涛等利用嗜热芽孢杆菌改善酱香型白酒品质[14]。黄光荣等研究发现嗜热芽孢杆菌可合成蛋白酶HS08[15]。董艺凝等对嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶进行了研究[16]。汪璞等分离制备了T1脂肪酶[17]。下一步将对所分离嗜热菌W1的产酶能力进行分析。

本研究采用纯培养方法对温泉微生物群落结构做了初步分析，但由于纯培养方法仅能分离到自然环境中1%的微生物，存在分离量低的弊端，不能准确的反映温泉微生物的群落结构组成，因此，课题组将采用分子生物学方法做进一步研究，加强陕县温泉微生物资源的开发和应用，服务三门峡经济社会发展。

图2 温度对嗜热菌W1生长的影响

图3 pH对嗜热菌W1的影响

表2 嗜热菌生理生化特征

3 结论

采用纯培养方法分析了陕县温泉微生物群落结构组成，结果表明，可培养微生物达到103cfu/ml，细菌占绝对优势，放线菌次之，未检测到真菌。分离出一株嗜热菌W1，杆状，革兰氏阳性，最适生长温度为65℃，最适生长pH为8，能够利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖，碳源利用形式多样，适应能力较强；淀粉水解、明胶水解、甲基红实验及葡萄糖发酵实验结果均为阳性；吲哚反应、VP反应和H2S反应结果均为阴性；初步鉴定为嗜热脂肪地芽孢杆菌属。

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（责任编辑 卞建宁）

Q933

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：1671-9123（2016）01-0137-03

2015－12－05

张晶（1985-），女，河南三门峡人，三门峡职业技术学院食品园林学院讲师。