膝关节骨关节炎患者外周血脂联素基因+45T/G和+267G/T单核苷酸多态性观察

向东，唐茂丹，陈翰博，詹东

(1 昆明医科大学第二附属医院，昆明650101；2 昆明理工大学医学院人体解剖学教研室；3昆明医科大学基础医学院实验教学中心)



膝关节骨关节炎患者外周血脂联素基因+45T/G和+267G/T单核苷酸多态性观察

向东1，唐茂丹2，陈翰博1，詹东3

(1 昆明医科大学第二附属医院，昆明650101；2 昆明理工大学医学院人体解剖学教研室；3昆明医科大学基础医学院实验教学中心)

目的 观察膝关节骨关节炎(OA)患者外周血脂联素基因+45T/G和+267G/T单核苷酸多态性。方法 255例膝关节OA患者为观察组，201例健康志愿者为对照组。抽取两组外周静脉血 5mL，采用PCR-限制性片段长度多态性法测定外周血脂联素基因+45T/G和+267G/T位点的单核苷酸多态性。结果 两组外周血脂联素基因+45T/G和+267G/T位点SNP均符合HWE平衡。观察组外周血脂联素基因+45T/G、+267G/T等位基因T、G频率分别为64.6%和35.4%、29.2%和70.8%，与对照组相比，P均>0.05。轻度、中重度膝关节OA患者外周血脂联素基因+267G/T位点等位基因T、G频率32.9%和67.1%、24.1%和75.9%相比，P均<0.05。结论 中重度膝关节OA患者外周血脂联素基因+267G/T位点上多为GG型基因或携带等位基因G。

骨关节炎；膝关节骨关节炎；脂联素；基因多态性；单核苷酸多态性

骨关节炎(OA)是一种慢性退行性关节病，常见于膝关节、髋关节、脊柱等承重关节，老年人和女性为其好发人群。主要临床表现为关节功能减弱、滑膜炎、关节周围骨赘形成、关节腔变窄、软骨下骨硬化和关节软骨进行性破坏，目前尚无有效治疗方法。深入研究OA的发病原因和机制对其治疗有重要意义。生长分化因子5(GDF 5)[1]、白介素-1β(IL-1β)[2]、白介素-6(IL-6)[3]、基质金属蛋白酶-3(MMP 3)[4]等基因的核苷酸多态性与骨关节炎发病密切相关。脂联素是一种只在脂肪细胞表达的激素，参与肥胖、糖尿病、冠心病等疾病的发生发展，同时其还具有抗炎作用。研究发现，膝关节OA患者血浆脂联素水平明显高于健康对照者[5]，关节液脂联素水平与膝关节炎严重程度呈负相关[6]。人类脂联素基因位于染色体3q27，全长17 kb，包括3个外显子，多个单核苷酸多态性位点与BMI、肥胖等代谢性疾病密切相关，但位于2号外显子的+45T/G(rs2241766)和位于2号内含子的+267G/T (rs1501299)单核苷酸多态性与OA相关性方面报道较少。2011年6月～2015年1月，我们观察了膝关节OA患者外周血脂联素基因+45T/G和+267G/T单核苷酸多态性,现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2011年6月～2015年1月间昆明医科大学第二附属医院收治的膝关节OA患者(观察组)255例，其中男39例、女216例，年龄(64.2±6.7)岁，BMI 24.76±3.84，腰围(74.6±8.3)cm，臀围(86.9±9.1) cm，腰臀比0.86±0.2。膝关节OA纳入标准为1995年美国风湿病协会修订的膝关节OA诊断标准，其中病情轻度(KL评分2分)68例、中度(KL评分3分)94例、重度(KL评分4分)93例、中重度(KL评分>2分)187例。排除标准为患有继发性OA和其他类型关节炎、系统炎症、免疫系统疾病、慢性疾病、肿瘤和已行手术治疗者。另选择201例健康志愿者为对照，其中男68例、女133例，年龄(65.2±6.7)岁，BMI 26.87±3.15，腰围(92.8±7.9) cm，臀围(97.3±9.3) cm，腰臀比0.95±0.2，均未出现OA和其他类型关节炎的症状和体征，无OA家族史，无痛风、系统性红斑狼疮、银屑病、血色病，既往无关节感染和关节外伤。两组性别、BMI、腰围、臀围和腰臀比间差异具有统计学意义。本研究经昆明医科大学第二附属医院伦理委员会批准。纳入者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 膝关节患者外周血脂联素基因+45T/G 和+267G/T位点SNP观察 清晨抽取两组外周静脉血 5 mL，离心后采用Illustra Blood GenomicPrep Midi Flow试剂盒提取DNA，采用PCR-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)测定脂联素基因+45T/G 和+267G/T位点。+45T/G上游引物序列为5′-TCCTTTGTAGGTCCCAACT-3′，下游引物序列为5′-GCAGCAAAGCCAAAGTCTTG-3′。+267G/T上游引物序列为5′-ACACTGATATAAACGCCATGAA-3′，下游引物序列为5′-GCAGCAAAGCCAAAGTCTTC-3′[7]。+45T/G 反应条件为：95 ℃、15 min；95 ℃、30 s， 56 ℃、30 s，72 ℃、60 s循环35次；72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物用限制性核酸内切酶BspH1 37 ℃水浴消化16 h，2.5%琼脂糖明胶电泳，溴化乙锭染色后紫外线观察。+267G/T反应条件为：95 ℃、10 min；95 ℃、30 s, 48 ℃、60 s, 72 ℃、60 s循环40次；72 ℃、7 min。PCR扩增产物用限制性核酸内切酶BgⅡ 37 ℃水浴消化16 h，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后紫外线观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。分析样本基因频率是否符合哈迪-温伯格平衡(HWE)采用 Michael H Courts (2005～2008) 在线分析程序(www.coursehero.com)。采用直接计数法计算基因型及等位基因频率，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组外周血脂联素基因+45T/G 和+267G/T 位点SNP均符合HWE平衡。观察外周血组脂联素基因+45T/G为TT基因型105例(41.2%)、TG基因型120例(47.1%)、GG基因型30例(11.8%)，T等位基因频率64.6%，G等位基因频率35.4%。对照组外周血脂联素基因+45T/G为TT基因型98例(48.8%)、TG基因型78例(38.8%)、GG基因型25例(12.4%)，T等位基因频率68.2%，G等位基因频率31.8%。两组间基因型及等位基因频率间差异均无统计学意义(P均>0.05)。

观察组外周血脂联素基因+267G/T为GG基因型130例(51.0%)、GT基因型101例(39.6%)、TT基因型24例(9.4%)，G等位基因频率70.8%，T等位基因频率29.2%。对照组外周血脂联素基因+267G/T为GG基因型103例(51.2%)、GT基因型81例(41.3%)、TT基因型17例(8.5%)，G等位基因频率71.4%，T等位基因频率28.6%。两组间基因型及等位基因频率间差异均无统计学意义(P均>0.05)。

不同病情程度膝关节OA患者外周血脂联素基因+45T/G 和+267G/T 基因型见表1。轻度和中重度骨关节患者外周血脂联素基因SNP +267G/T位点的基因频率存在差异(P=0.012)，中重度骨关节炎患者组的GG型基因更多；相同位点等位基因频率也存在统计学差异(P=0.041)，中重度骨关节炎患者组含有更多的等位基因G。+45T/G位点组间差异均无统计学意义(P均>0.05)。轻、中、重和中重度膝关节OA患者外周血脂联素基因+45T/G位点T等位基因频率28.2%、36.4%、35.4%和71.8%, G等位基因频率23.9%、37.8%、38.3%和76.1%，轻、中、重和中重度膝关节OA患者外周血脂联素基因+267G/T位点G等位基因频率分别为24.1%、38.5%、37.4%和75.9%, T等位基因频率32.9%、32.95、34.2%和67.1%。

表1 不同病情程度膝关节OA患者外周血脂联素基因+45T/G 和+267G/T 基因型

3 讨论

OA致病因素分为影响关节生物力学负重的局部因素(如生物力学、运动和肥胖等)和与OA发展相关的系统因素(如衰老、性别和遗传等)[8]。衰老可使关节软骨退化而致OA发生[9]，本研究患者年龄50～80岁，平均(65.2±6.7)岁，与以往报道的发病年龄一致；以女性患者(绝经)为主，说明女性激素变化会增加患病危险[10]。OA组BMI值显著高于对照组，提示肥胖是危险因素，而BMI并不能反映脂肪和骨骼肌质量的变化[11]。Lee等[12]的研究表明肌减少症性肥胖比非肌减少症性肥胖与OA发病相关性更强，腰臀比是肌减少症性肥胖指标之一，OA组腰臀比显著高于对照组。

既往研究发现，膝关节OA患者关节滑膜液中脂联素水平和病情严重程度呈负相关[6]，但膝关节OA患者关节滑膜液中脂联素水平与健康对照者差异无统计学意义[13]。促炎趋化因子TNF-α对脂联素有负调控作用；通过降低NF-κB 活性，脂联素还可减少被LPS刺激的巨噬细胞表达TNF-α[14]，从而降低巨噬细胞在炎症反应中的作用。脂联素不仅具有抗炎功能，在代谢方面也具有积极的功能。体内和体外实验发现，成骨细胞和软骨细胞不仅表达脂联素还表达脂联素受体[15～17]， 通过自分泌或者旁分泌，脂联素作用于成骨细胞上的脂联素受体1和AMPK信号通路，诱导成骨细胞和软骨细胞的增生、分化、生物矿化，还促进细胞Ⅱ、Ⅹ型胶原蛋白，糖蛋白的合成和表达。同时，脂联素基因核苷酸多态性研究多见于国内外报道，并与多种疾病相关，主要包括代谢综合征、2型糖尿病、肥胖、冠心病等与代谢相关的疾病。但国内还未见脂联素基因核苷酸多态性与骨关节炎的相关性研究，而且由于人群和种族的差异，结果可能并不完全相同。所以有必要对我国汉族人群进行本项研究。笔者选取了研究脂联素基因核苷酸多态性较为普遍的位点：+45T/G(rs2241766)和+267G/T (rs1501299)。SNP+45位点等位基因突变T→G或+267位点等位基因G携带者脂联素表达降低，从而减弱脂联素在抗炎中的作用；抑制外周组织对葡萄糖的摄取和利用，增高血糖，导致糖和脂肪代谢失衡[18,19]。本研究结果中，脂联素基因SNP+45T/G和+267G/T位点的基因型和等位基因频率分布上，对照组与观察组无统计学差异。但是，OA患者病情严重程度按KL评分分组后，在中重度组(KL评分>2分)与轻度组(KL评分=2分)之间，SNP+267G/T位点的基因型和等位基因频率都出现了统计学差异。由此笔者推测SNP+267G/T位点的基因型GG和等位基因G与骨关节炎的疾病发生和危险因素无相关性，但与OA发病后疾病发展和其严重程度有关。多种混合因素导致OA发病后，在脂联素基因SNP+267G/T位点上G等位基因(优势等位基因)能够降低患者脂联素的表达，减弱脂联素的抗炎作用，促进软骨和滑膜炎症反应，导致软骨细胞功能障碍、软骨无法再生，滑膜细胞不能正常分泌透明质酸、关节面摩擦增大；同时抑制外周组织摄取和利用葡萄糖，增高血糖，导致糖和脂肪代谢障碍,关节液成分变化，影响关节软骨代谢，使得缺损的软骨无法及时修复。加重骨关节炎的严重程度，提高了KL评分，使轻度OA患者更可能发展为中重度患者。在SNP+45位点非优势等位基因G与机体脂联素表达相关，然而64.6%的OA患者携带与脂联素表达不相关的优势等位基因T，因此，未发现SNP+45位点与OA或其病情程度的相关性。但SNP+267G/T如何影响脂联素基因功能仍不十分清楚，它可能和其他变异的脂联素基因或与脂联素基因相接近的基因发生连锁不平衡，从而影响脂联素在血清中的表达。研究人员已经发现，位于3′非编码区(UTR)SNP+2019位点插入的碱基“A”可以和SNP+267G/T位点的碱基发生完全的连锁不平衡，而3′UTR一直被认为是调控脂联素基因表达的重要因子，具有核心地位，在3′UTR SNP+2019位点插入碱基就会影响mRNA的转录、翻译和降解[20]。而且大多数基因中，3′UTR的多态性会直接影响mRNA的稳定性，脂联素基因3′UTR可能也具有相似的功能。

综上所述，中重度膝关节OA患者脂联素基因+267G/T位点上多为GG型基因或携带等位基因G。脂联素基因+267G/T位点上的基因型为GG或等位基因为G的膝关节OA患者病情更易进展为中重度。

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Observation of +45T/G and +267G/T single nucleotide polymorphisms of adiponectin gene in patients with knee osteoarthritis

XIANGDong1,TANGMaodan,CHENHanbo,ZHANDong

(1TheSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650101,China)

Objective To observe the single nucleotide polymorphisms (SNPs) of +45T/G and +267G/T loci in adiponectin gene of patients with knee osteoarthritis (OA). Methods The genotypes and allele frequencies of SNPs of +45T/G and +267G/T loci in adiponectin gene from plasma of 255 knee OA patients (observation group) and 201 healthy volunteers (control group) were detected with polymerase chain reaction-based restriction fragment-length polymorphism (PCR-RFLP). Results Two SNPs met Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). T and G allele frequencies of +45T/G and +267G/T loci of adiponectin gene were respectively 64.6%, 35.4%, and 29.2%, 70.8% in the observation group, and no significant difference was found as compared with that of the control group (allP>0.05). But there was statistic difference between low-grade group and moderate to severe-grade group of OA patients at SNP +267G/T locus (32.9%, 67.1% and 24.1%,75.9%) (allP<0.05). Conclusion At the +267G/T locus of adiponectin gene of moderate to severe-grade OA patients, there are more GG genotype or carrying G allele.

osteoarthritis; knee osteoarthritis; adiponectin; gene polymorphism; single nucleotide polymorphisms

向东(1973-)，男，主治医师，主要研究方向为骨创伤、骨关节炎、急诊外科。E-mail:dor_xiang_km@sina.com

简介：詹东(1984-)，男，硕士学位，主要研究方向为关节炎、单核苷酸多肽性、外科手术入路。E-mail:237476375@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.007

R394

A

1002-266X(2016)39-0023-04

2016-05-18)