1,25-二羟基维生素D3对人肾小球系膜细胞增殖、周期的影响及其机制

聂晴晴，唐玉玲，赵丹，张春江，杨晓萍，

( 1石河子大学医学院,新疆石河子832000；2石河子大学医学院第一附属医院)



1,25-二羟基维生素D3对人肾小球系膜细胞增殖、周期的影响及其机制

聂晴晴1，唐玉玲1，赵丹2，张春江2，杨晓萍1，2

( 1石河子大学医学院,新疆石河子832000；2石河子大学医学院第一附属医院)

目的 观察1,25-二羟维生素D3(1,25-(OH)2D3)对人肾小球系膜细胞株增殖及细胞周期的影响，并探讨其可能作用机制。方法 对数生长期人肾小球系膜株细胞分为A、B、C、D组，分别加入终浓度为10-8mol/L的1,25(OH)2D3+含5% FBS的L-DMEM培养基、5 mg/L雷帕霉素+含5%FBS的L-DMEM培养基、5 mg/L雷帕霉素+终浓度为10-8mol/L 1,25(OH)2D3+含5%FBS的L-DMEM培养基。给药48 h时观测各组细胞增殖及细胞周期分布，检测各组细胞真核细胞翻译起始抑制因子4E结合蛋白(4E-BP1)、磷酸化4E-BP1蛋白。结果 给药48 h时A、B、C组的细胞凋亡率分别为38.02%、55.62%、99.23%，组间比较,P均<0.05。给药48 h时，A、B、C组G1期细胞所占比例明显高于D组(P均<0.05)，S、G2/M期细胞所占比例明显低于D组(P均<0.05)；B、C组G1期细胞所占比例明显高于A组(P均<0.05)，S、G2/M期细胞所占比例明显低于D组(P均<0.05)；C组G1期细胞所占比例明显高于B组(P均<0.05)，S、G2/M期细胞所占比例明显低于B组(P均<0.05)。A、B、C组细胞4E-BP1、磷酸化4E-BP1蛋白相对表达量及磷酸化4E-BP1/4E-BP1均低于D组(P均<0.05)；B、C组细胞4E-BP1、磷酸化4E-BP1蛋白相对表达量及磷酸化4E-BP1/4E-BP1均低于A组(P均<0.05)；C组细胞4E-BP1、磷酸化4E-BP1蛋白相对表达量及磷酸化4E-BP1/4E-BP1均低于B组(P均<0.05)。结论 1,25(OH)2D3可抑制人肾小球系膜细胞株的增殖，阻滞细胞周期于G1期，其机制可能为1,25-(OH)2D3下调4E-BP1的表达。

人肾小球系膜细胞株；1,25-二羟维生素D3；真核细胞翻译起始抑制因子4E结合蛋白；细胞增殖；细胞周期

肾小球系膜细胞弥漫性增生、系膜基质增多最终导致的肾小球硬化及间质纤维化几乎是所有慢性肾小球疾病的共同异常表现，也是终末期肾病(ESRD)的主要特征[1]。因此，寻找系膜细胞异常增生的原因并抑制其增生已成为肾小球疾病治疗的关键。1,25-二羟维生素D3(1,25-(OH)2D3)是维生素D的活性形式之一，可通过与靶器官上特异性受体-核维生素D受体(nVDR)结合，调节机体的钙、磷代谢[2]。最新研究[3]发现，1,25-(OH)2D3可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和分化、调节机体免疫、保护机体脏器等功能。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种能够调节细胞生长和细胞周期进程的丝/苏氨酸蛋白激酶，是参与细胞增殖与凋亡的通路之一。其广泛存在于酵母及所有的真核生物中，可与生长因子等信号结合，发挥多种调控作用[4]。真核细胞翻译起始抑制因子4E结合蛋白(4E-BP1)和核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(P70S6K)是mTOR最重要的两个下游底物。4E-BP1是mTOR下游的直接作用底物，属小分子蛋白，是真核细胞翻译启动因子(elF4E)的负性抑制因子。目前1,25-(OH)2D3对人肾小球系膜细胞4E-BP1和P70S6K的影响尚未见报道。2014年8月～2015年5月，我们观察了1,25-(OH)2D3对人肾小球系膜细胞株增殖及细胞周期的影响，并探讨其可能作用机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人肾小球系膜细胞株购于湘雅医学院中心实验室，置于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基、5 %CO2、37 ℃培养箱中培养，细胞贴壁生长70%～80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化传代继续培养备用。1,25(OH)2D3、L-DMEM培养基(低糖DMEM培养基，美国Sigma公司)；雷帕霉素(上海生工公司)； 胎牛血清(HyClone公司)；小鼠抗人β-actin 单克隆抗体、兔抗人4E-BP1、P-4E-BP1多克隆抗体(Cell Signaling 公司)；山羊抗兔 IgG 二抗、山羊抗小鼠 IgG 二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；CCK-8试剂盒(购自美国Sigma公司)。流式细胞仪(德国Partec公司)

1.2 人肾小球系膜细胞分组及1,25(OH)2D3给药方法 取对数生长期人肾小球系膜细胞，加入无血清L-DMEM培养基培养24 h。将细胞分为A、B、C、D组，A、B、C、D组分别加入终浓度为10-8mol/L的1,25(OH)2D3+含5% FBS的L-DMEM培养基、5 mg/L雷帕霉素+含5%FBS的L-DMEM培养基、5 mg/L雷帕霉素+终浓度为10-8mol/L 1,25(OH)2D3+含5%FBS的L-DMEM培养基、含5 %FBS的L-DMEM培养基，置于5 %CO2、37 ℃培养箱中培养，备用。

1.3 各组细胞增殖情况观测 采用 CCK-8法观察各组细胞增殖情况。取给药48 h各组细胞,1×104/mL、200 μL/孔接种于96孔板，每组6个复孔， PBS冲洗1次，加入10 μL CCK-8溶液，培养4 h后振荡15 min。所有操作均严格按照使用说明书进行。采用酶标仪检测各组细胞在450 nm波长处的吸光度值(A450)，重复3次，取平均值计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%。

1.4 各组细胞周期观察 采用流式细胞术观察各组细胞周期期分布情况。取给药48 h对数生长期各组细胞,6×105/瓶接种于培养瓶中，胰蛋白酶消化并收集细胞，70%乙醇(4 ℃预冷)重悬细胞固定，4 ℃过夜。1 000 r/min离心5 min ,吸弃上清，PBS洗2次，加入RNA酶于500 μL的1×Buffer重悬细胞使其终浓度为10 g/L，37 ℃避光孵育30 min，加入终浓度为50 mg/L的碘化丙啶(PI)染液，4 ℃避光反应30 min，加入PBS至2 mL，采用流式细胞仪观察各组细胞周期分布情况。

1.5 各组细胞4E-BP1、磷酸化4E-BP1蛋白检测 采用Western blotting法。取给药48 h对数生长期各组细胞, 4 ℃预冷PBS洗涤3次，加入300 μL预冷的RIPA裂解液于冰上裂解细胞，4 ℃12 000 r/min离心25 min，BCA法提取细胞总蛋白，取10 μL总蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗4 ℃过夜，TBST洗涤，加二抗室温孵育1 h，TBST洗涤，ECL显色，胶片曝光，扫描成像。采用Gelpro软件观察4E-BP1目的条带的灰度值，以β-actin作为内参，以目的蛋白与β-actin灰度值之比表示蛋白的相对表达量。计算磷酸化4E-BP1 /4E-BP1,实验重复3次，取平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，组间多重比较用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 给药48h时A、B、C组的细胞增殖抑制率分别为38.02%、55.62%、99.23%，组间两两抑制率比较，P均<0.05。

2.2 各组细胞周期比较 给药48h时各组细胞周期分布见表1。给药48h时，A、B、C组G1期细胞所占比例明显高于D组，S、G2/M期细胞所占比例明显低于D组(P均<0.05)；B、C组G1期细胞所占比例明显高于A组，S、G2/M期细胞所占比例明显低于D组(P均<0.05)；C组G1期细胞所占比例明显高于B组，S、G2/M期细胞所占比例明显低于B组(P均<0.05)。

表1 给药48 h时各组细胞周期分布(%.

2.3 各组细胞4E-BP1、磷酸化4E-BP1蛋白相对表达量及磷酸化4E-BP1/4E-BP1比较 给药48 h时各组细胞4E-BP1、磷酸化4E-BP1蛋白的相对表达量及磷酸化4E-BP1/4E-BP1比较见表2。

表2 给药48 h时各组细胞4E-BP1、磷酸化4E-BP1蛋白的相对表达量及磷酸化4E-BP1/4E-BP1比较

3 讨论

隶属于类固醇激素的1,25(OH)2D3是维生素D3的活性形式之一，它在体内钙磷代谢及免疫系统调节过程中扮演着多个重要角色，且可通过调控人体多种类型细胞的生长过程，如抑制多种类型免疫细胞、肿瘤细胞及肾小球系膜细胞增殖、分化相关基因，影响细胞的增殖、分化及凋亡[5，6]。在肿癌症治疗方面，Chiang等[7]研究发现MART-10在体内、体外能够抑制血管生成，阻碍肿瘤细胞生长及转移。Wahono等[8]证实，1,25(OH)2D3能够通过抑制多种高表达的免疫效应分子和分泌细胞(如Th17细胞、RORC、IL-17A、IL-23R、IFN-γ等)，调节系统性狼疮患者紊乱的免疫系统。Veldurthy等[9]调查发现，心血管疾病(CVD)、2型糖尿病、代谢综合征、骨骼疾病等多种慢性疾病患者体内钙、镁、维生素D水平相互关联，其异常水平成为患者死亡风险的独立危险因素。

4E-BP1是mTOR下游的直接作用底物，属小分子蛋白，是真核细胞翻译启动因子(elF4E)的负性抑制因子[12]。4E-BP1与elF4E的结合取决于4E-BP1的活性状态。4E-BP1的第37位及46位苏氨酸残基可被活化的mTOR磷酸化从而降低其与elF4E的亲和能力，二者分离。磷酸化的4E-BP1失去活性而解除了对elF4E的抑制作用，elF4E继而与mRNA 5′端帽子结构结合，启动mRNA翻译。相反，当4E-BP1被受抑制的mTOR去磷酸化时，两者结合形成复合物能有效阻止细胞蛋白的表达[12～14]。Iwenofu等[15，16]研究表明在细胞增殖过程中，磷酸化的4E-BP1及p70S6K的增多将减少正性调节蛋白的表达，增加负性调节蛋白的表达，抑制细胞G1期和S期中cyclin2-CDK复合物形成，使细胞周期停滞于G1期，从而抑制细胞增殖。Zoncu等[17]研究证实mTOR的下调可以分别加强4E-BP1及抑制p70S6K的表达，从而影响细胞增殖、生长与代谢。研究[18]表明：活化的mTOR引起下游蛋白4E-BP1、p70S6K的磷酸化并降低其活性的过程参与糖尿病(DM)大鼠肾脏早期肥大的形成。

雷帕霉素是mTOR的特异性抑制剂，与细胞胞质受体亲免素(KFBP12)结合后形成复合物KFBP12-雷帕霉素后抑制mTOR的功能。因此，雷帕霉素可以阻止4E-BP1的磷酸化和帽依赖性的翻译从而抑制mTOR/4E-BP1信号通路的活化，抑制细胞增殖，阻滞细胞生长。本研究结果发现与D组比较，B组G1期细胞比例显著增加，S期显著减少，细胞周期阻滞于G1期；Western blotting法蛋白检测显示4E-BP1蛋白的相对表达量增高，磷酸化4E-BP1、磷酸化4E-BP1/4E-BP1明显降低，验证了mTOR/4E-BP1信号通路参与了HMC增殖过程的调控，雷帕霉素抑制mTOR活性、促进4E-BP1的表达并降低P-4E-BP1的表达，抑制细胞内翻译启动过程，阻滞细胞增殖过程。

研究证实一些药物在肿瘤细胞中能通过抑制mTOR/4E-BP1信号通路降低4E-BP1磷酸化水平介导细胞凋亡与自噬[19]。本课题组前期研究证实,1,25(OH)2D3阻滞系膜细胞于增殖周期，对人系膜细胞的生长进程有显著抑制作用[10]。然而，1,25(OH)2D3是否会通过mTOR/4E-BP1信号通路调控HMC增殖与凋亡，目前未见相关文献。

本课研究用1,25(OH)2D3单独或联合mTOR特异性抑制剂雷帕霉素干预体外培养的人肾小球系膜细胞，A组、B组细胞周期阻滞于G1期。其作用机制可能为细胞有丝分裂需要更多蛋白时，1,25(OH)2D3通过干预mTOR/4E-BP1信号通路提高4E-BP1的表达、降低其磷酸化水平，促进加强细胞内生物性蛋白合成的抑制作用，进而阻滞细胞周期进展，抑制细胞增殖。与D组比较A组、B组4E-BP1蛋白的相对表达量显著升高，P-4E-BP1表达量显著降低，磷酸化-4E-BP1/4E-BP1降低。与B组比较，C组4E-BP1表达显著升高，磷酸化-4E-BP1/4E-BP1表达显著降低。说明25(OH)2D3可从蛋白水平促进4E-BP1表达，并抑制P-4E-BP1水平。同时协同雷帕霉素上调4E-BP1的表达，并减少4E-BP1磷酸化，对人肾小球系膜细胞的增殖起到抑制作用。

综上所述，1,25(OH)2D3可抑制人肾小球系膜细胞株的增殖，阻滞细胞周期于G1期,其机制可能为1,25(OH)2D3下调4E-BP1的表达。

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Effects of 1,25(OH)2D3on proliferation and cell cycle of human glomerular mesangial cells

NIEQingqing1,TANGYuling,ZHAODan,ZHANGChunjiang,YANGXiaoping

(1MedicalCollegeofShiheziUniversity,Xinjiang832000,China)

Objective To investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3[1,25(OH)2D3] on cell proliferation and cell cycle of human glomerular mesangial cells and the possible mechanism.Methods Human mesangial cells in the logarithmic phase were cultured in vitro and then were divided into four groups: groups A, B, C and D. Four groups were separately added with such culture mediums: group A with 10-8mol/L 1,25(OH)2D3+L-DMEM medium containing 5% fetal bovine serum (FBS), group B with 5 μg/mL rapamycin +L-DMEM medium containing 5% FBS, group C with 5 μg/mL rapamycin +10-8mol/L 1,25(OH)2D3+L-DMEM medium containing 5% FBS, and group D with the L-DMEM medium containing 5% FBS. After 48-hour administration, we observed the cell proliferation and cell cycle distribution in each group. The protein expression of eukaryotic cell translation initiation inhibitory factor 4E binding protein (4E-BP1) and phosphorylated 4E-BP1 (P-4EBP1) in cells was determined by Western blotting. Results At 48 h, the cell apoptosis rates of the groups A, B and C were 38.02%, 55.62% and 99.23%, respectively, and significant difference was found between them (P<0.05). At 48 h, the proportion of cells in the G1phase of groups A, B and C was significantly higher than that of group D (allP<0.05), the proportion of cells in the S, G2/M phase was clearly lower than that of group D (allP<0.05). The proportion of cells in the G1phase of groups B and C was significantly higher than that of group A (allP<0.05), and the proportion of cells in the S, G2/M phase was clearly lower than that of group D (allP<0.05). The proportion of cells in the G1phase of group C was higher than that of group B (allP<0.05), and the proportion of cells in the S, G2/M phase was lower than that of group B (allP<0.05). The 4E-BP1 and P-4E-BP1 protein expression and P-4E-BP1/4E-BP1 of groups A, B and C was lower than that of group D (allP<0.05). The 4E-BP1 and P-4E-BP1 protein expression and P-4E-BP1/4E-BP1 of groups B and C was lower than that of group A (allP<0.05). The 4E-BP1 and P-4E-BP1 protein expression and P-4E-BP1/4E-BP1 of group C was lower than that of group B (allP<0.05).Conclusion 1,25(OH)2D3may inhibit the glomerular mesangial cell proliferation and block the cell cycle in G1phase through down-regulating the expression of 4E-BP1.

human glomerular mesangial cell line; 1,25-dihydroxyvitamin D3; eukaryotic cell translation initiation inhibitory factor 4E binding protein; cell proliferation; cell cycle

国家自然科学基金资助项目(81160090)。

聂晴晴(1989-)，女，石河子大学在读硕士研究生，研究方向为肾小球疾病的发病机制。E-mail: nieqq1224@163.com

简介：杨晓萍(1965-)，女，博士，主任医师，研究方向为肾小球疾病的发病机制。E-mail: sbkyxp@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.004

R692.31

A

1002-266X(2016)39-0012-04

2016-06-23)