广东汉族人群D18S51基因座等位基因分型现象分析

兰菲菲，陈延冰，丁红珂，杜 丽，张 彦，尹爱华

广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东广州 511442

短串联重复序列(STR)是人类基因组DNA中遗传学标记之一，在法医学研究中具有重要应用价值。在鉴定中会遇到STR基因座的特殊分型现象，例如三带型等位基因和off-ladder(OL)现象等。三带型等位基因的发生机制较为复杂，发生率不高，有研究表明中国人群中TPOX等基因座的检出率在0.01%～0.09%[1]，陈玲等[2]报道中国人群D18S51基因座检出率为0.013 7%。而OL现象较常见，有报道显示不同STR基因座均会发生OL现象[3-4]。正确计算特殊分型基因座的亲权指数(PI)及计算和(或)命名OL等位基因，对亲权鉴定的结论和科学性均有不同程度的影响。本文对发现的D18S51基因座特殊分型现象进行了分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本中心日常受理检测的9 419例研究对象，均在本中心进行三联体(母亲、孩子与被检父亲)或二联体(孩子与被检父亲或母亲)亲子鉴定，研究对象均为广东地区汉族人群。本研究经本中心伦理委员会审核通过，所有研究对象均已知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1DNA提取 全部血液标本采用Chelex-100法提取基因组DNA。血液轻轻混匀后，吸取2 μL全血至1.5 mL的离心管中，加入1 mL灭菌纯净水，剧烈震荡30 s，室温放置30 min；13 000 r/min离心3 min，收集沉淀；在沉淀中加200 μL 5%的Chelex-100悬液，用震荡仪剧烈震荡，震荡后瞬时离心，放入恒温水浴箱中56 ℃孵育30 min；100 ℃煮沸8 min，取出后剧烈震荡，13 000 r/min离心3 min，吸取上清液保存于4 ℃冰箱备用。

1.2.2多重PCR扩增 取上清液1 μL，采用Powerplex®21扩增体系(购自美国Promega公司)，按照操作说明书进行20个常染色体和1个性染色体STR基因座的多重PCR扩增。

1.2.3STR基因座的等位基因分型 每个标本取1 μL PCR扩增产物、9 μL甲酰胺与0.5 μL的Powerplex®21体系内标充分混合均匀，用3500XL基因分析仪(购自美国AB公司)进行毛细管电泳，标记每个STR基因座的扩增片段大小。按照Powerplex®21体系操作说明，利用GeneMapper®ID-X软件(购自美国AB公司)分析电泳后的数据，以Powerplex®21体系的每个STR基因座等位基因分型标准物作为标准，获取被检测标本的STR基因座的等位基因分型。

1.2.4D18S51基因座特殊分型等位基因的验证 选取Powerplex®21体系检测发现的三带型等位基因及OL等位基因的家系标本，重新提取DNA，采用IdentifilerTM体系(购自美国AB公司)进行验证。

1.2.5OL等位基因的分型计算 根据GeneMapper®ID-X软件中给出的OL等位基因片段大小，结合基因分型标准物中D18S51基因座等位基因的大小，计算并减掉基因座的漂移率，计算OL等位基因的大小后进行等位基因分型的命名[3]。

1.3统计学处理 使用GeneMapper®ID-X软件对等位基因进行计算并命名，计数资料以例数和百分率表示。

2 结 果

2.1D18S51基因座三带型等位基因分型结果 利用Powerplex®21体系进行20个常染色体STR基因座检测，在9 419例研究对象中发现1个家系的孩子D18S51基因座存在三带型等位基因17，23，24(Type1类型)，峰高比例约为3∶2∶1，等位基因17的峰面积约为等位基因23和24之和。该家系标本重新提取DNA后经过IdentifilerTM体系检测验证，确定了该孩子在D18S51基因座发生三带型等位基因现象。该三带型等位基因基因型频率为0.010 6%(1/9 419)。见图1。

注：A为父亲；B为孩子；C为母亲。

2.2D18S51基因座OL等位基因分型结果 利用Powerplex®21体系在三联体亲子鉴定的家系中检测到母亲和孩子存在OL等位基因，采用IdentifilerTM体系重复检测证实OL等位基因的存在。父亲的等位基因分型为17,19；孩子的等位基因分型为19,OL；母亲的等位基因分型为16,OL。OL等位基因的基因型频率为0.021 2%(2/9 419)。见图2。

注：A为父亲；B为孩子；C为母亲。

2.3OL等位基因的分型计算 本研究中孩子D18S51基因座的OL等位基因，减掉漂移率(0.04 bp)，OL等位基因(214.79 bp)比Ladder中D18S51基因座的等位基因27(210.66 bp)大4.09 bp，而D18S51基因座为4个核苷酸的重复，即OL等位基因比Ladder中D18S51基因座的等位基因27大约1个重复序列(4.09/4=1.023)，因此，孩子的OL等位基因命名为28。母亲D18S51基因座的OL等位基因，减掉漂移率(0.05 bp)，OL等位基因(214.81 bp)比Ladder中D18S51基因座的等位基因27(210.66 bp)大4.1 bp，即OL等位基因比Ladder中D18S51基因座的等位基因27大约1个重复序列(4.1/4=1.025)，因此，母亲的OL等位基因命名为28。见图3。

注：A为孩子；B为母亲。

3 讨 论

三带型等位基因和OL等位基因是STR基因座分型中的主要特殊分型[5-6]，在应用STR基因座分型技术进行的临床检测和分析(例如亲权鉴定或染色体非整倍体快速诊断)中较为重要。在健康人群中，常染色体的单个STR基因座进行PCR扩增后电泳得到的基因分型是双等位基因或者单等位基因，图谱表现为杂合子的2条带(2个基因峰)，或者纯合子的1条带(1个基因峰)，并且基因分型一般在等位基因分型标准物范围之内。特殊情况下，单个STR基因座分型会出现3条带(3个基因峰)，即STR基因座的三带型等位基因。DNA复制过程中的碱基错配、滑动或者核心重复序列的插入或缺失、体细胞突变等均可导致三带型等位基因的出现[7]。在分析STR基因座的等位基因分型时，采用各STR基因座的等位基因与检测体系的等位基因分型标准物进行比较，再根据Ladder的基因分型命名得到STR基因座等位基因的分型，出现在Ladder之外的特殊分型即OL等位基因。由于STR基因座核心重复序列在不同种族、不同地区人群和个体间有一定的差异性，实际检测中会遇到OL等位基因。

本研究通过分析9 419例研究对象20个常染色体STR基因座的等位基因分型，在D18S51基因座发现了三带型等位基因分型17,23,24和OL稀有等位基因28，基因型频率分别为0.010 6%和0.021 2%。其中三带型等位基因属于Type1类型，3个等位基因峰高度不平衡，比例为3∶2∶1，且等位基因17的峰面积约为等位基因23和24的面积之和。其中，等位基因23和24只相差1个核心序列，可能因为该个体D18S51基因座原来的杂合子其中的1个等位基因发生了滑动错配或者体细胞突变，产生了2个等位基因[7-8]。Type1类型三带型等位基因相对Type2类型较为多见，Type2类型的三带型等位基因的3条带峰高度平衡，有研究推测与杂合子基因座发生了染色体重新排列有关[8]。OL等位基因根据其分布可以分为2种情况：一是OL等位基因在该基因座的基因分型标准物范围之内，位于2个等位基因之间；二是OL等位基因超出该基因座的基因分型标准物范围[9]。本研究发现的D18S51基因座OL等位基因28超出了Powerplex®21体系中该基因座Ladder的最大范围27，是稀有等位基因，发生频率较低。因为与基因座的亲权指数计算相关，OL等位基因的正确命名较为重要，过滤漂移率之后，经过计算，孩子和母亲的OL等位基因命名为28，由母亲遗传给孩子。

许泽辉等[10]在中国人群中发现三联体亲子鉴定的母亲发生了D18S51基因座三带型等位基因17,18,19，父亲和孩子分型正常。有研究发现母子单亲鉴定中孩子在D18S51基因座检测出三带型等位基因15,16,17，母亲分型正常[11]。唐剑等[12]发现D18S51基因座存在的三带型等位基因14,16,18。除此之外，D18S51基因座的OL等位基因丢失及突变均有报道[13-14]。在检测中遇到特殊分型现象，首先要用不同检测试剂盒验证其发生的真实性，排除试验过程中标本污染等因素。本研究应用Powerplex®21体系和IdentifilerTM体系对发现的D18S51基因座三带型及OL等位基因进行验证，2种检测试剂盒的分型结果相同。另一个关键环节为基因座亲权指数的计算及OL等位基因的命名，对于计算及命名的具体方法，目前国内尚无国家标准及行业标准。本研究中孩子D18S51基因座的等位基因23遗传自母亲，推测24可能由等位基因23突变形成。亲权指数可参考应用以下2种计算方式：(1)将等位基因24由23突变而来的因素考虑在内，亲权指数=X/Y=μm/(2p23p24)[1]，μm为母源性突变的平均突变率[15]；(2)将等位基因23和24看作一个整体，根据双等位基因的方法计算[16]，亲权指数=X/Y=1/(2p17)。OL等位基因根据基因分型标准物的分型标准和漂移率命名。由于亲代和子代中遗传的稀有等位基因发生频率很低，OL基因座的亲权指数可考虑使用D18S51基因座的最小等位基因频率计算。

本研究利用Powerplex®21体系检测分析广东汉族人群D18S51基因座的特殊分型现象，其中D18S51基因座的三带型等位基因分型17,23,24在STRBase数据库(http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/)中尚未见收录，是新发现的三带型等位基因。在广东汉族人群中发现D18S51基因座的OL等位基因28，数据库中暂无收录，可作为Powerplex®21体系Ladder等位基因的补充，可提高该检测体系的检测效能，本研究探讨了亲权指数的计算及命名，在鉴定实践中可作为参考。

综上所述，在鉴定中遇到D18S51等STR基因座的特殊分型现象，可利用含有相同STR位点的不同试剂盒验证基因座的分型是否正确，排除试验的非特异性扩增或污染、内标及Ladder等毛细管电泳的因素。本研究对OL等位基因进行了正确命名，计算了发生三带型等位基因或OL基因座的亲权指数，丰富了STRBase数据库中D18S51基因座的三带型等位基因分型，补充了广东汉族人群D18S51基因座OL等位基因分型和频率数据库。