葡萄球菌A蛋白-聚乙烯亚胺交联物的制备及其理化特性观察

2016-12-27刘云刘晓芬翟源慧张萃刘晓波

山东医药 2016年39期

关键词：共价亚胺聚乙烯

刘云，刘晓芬，翟源慧，张萃，刘晓波

(1川北医学院基础医学院，四川南充637000；2广东药科大学基础学院)

葡萄球菌A蛋白-聚乙烯亚胺交联物的制备及其理化特性观察

刘云1，刘晓芬2，翟源慧2，张萃2，刘晓波2

(1川北医学院基础医学院，四川南充637000；2广东药科大学基础学院)

目的制备葡萄球菌A蛋白-聚乙烯亚胺交联物(SPA-PEI交联物)，并观察其理化性状。方法采用异型双功能交联剂N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)化学偶联法将葡萄球菌A蛋白(SPA)与聚乙烯亚胺(PEI)化学交联，用SephadexG75柱层析法纯化SPA-PEI交联物。采用SDS-PAGE法鉴定交联物的纯度；紫外分光光度法测定交联物的吸收峰；采用粒度及Zeta电位分析仪测定交联物的粒径及表面Zeta电位、酸碱滴定法测定交联物的质子缓冲能力。结果 SPA与PEI共价结合形成SPA-PEI交联物，且交联物的纯度较高。SPA-PEI交联物在280 nm处有一吸收峰，其吸收曲线与SPA类似。SPA-PEI交联物粒径为(185.0±28.5)nm，表明Zeta电位为(38.0±6.6)mV，提示其粒径范围合理，带有较强的正电荷，可结合带负电荷的核酸片段。SPA-PEI交联物的酸碱滴定曲线与PEI类似，均有一个明显的缓冲平台，提示该交联物具有较强的质子缓冲能力。结论成功地制备出纯度良好的SPA-PEI交联物。SPA-PEI交联物粒度分布较合理、表面带较强正电荷、并且具有较强的质子缓冲能力。

葡萄球菌A蛋白；聚乙烯亚胺；N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯；化学交联；核酸转移系统；吸收峰；粒径；Zeta电位；质子缓冲能力

非病毒型核酸转移载体具有安全性高、制备简便等特性，其中聚乙烯亚胺(PEI)尤为引人注目。PEI是一类多聚阳离子聚合物,带有强大正电荷，能通过静电作用与DNA片段结合，并包裹压缩DNA分子成球状而容易进入细胞,因此可作为核酸转移载体。PEI携带丰富氨基，由于其“质子海绵效应”易使携带的DNA逃脱溶酶体酶破坏而较多聚赖氨酸(PLL)等其他阳离子聚合物更高的基因表达效率，因此PEI被视为最有前途的非病毒核酸转移载体之一[1，2]。然而单纯PEI作为核酸转移载体却有重大缺陷，即无细胞组织特异性或靶向性，这也是目前非病毒型核酸载体研究中需要解决的关键问题。抗体是最常用的靶向性物质，具有独特的优势[3，4]。以特异性抗体作为靶向物质构建抗体-聚乙烯亚胺核酸载体，是PEI载体具有靶向性或特异性的重要途径。然而抗体与PEI的直接化学交联存在着步骤繁多、抗体活性易受损伤等问题[5，6]。葡萄球菌A蛋白(SPA)是一种性能稳定的小分子蛋白，能与IgG抗体以高亲和力、非共价迅速结合[5]。笔者设想，先将SPA与PEI形成葡萄球菌A蛋白-聚乙烯亚胺交联物(SPA-PEI交联物)，再将IgG抗体与SPA-PEI交联物混合即可形成抗体-聚乙烯亚胺靶向载体，其组成形式为Ab/SPA-PEI，将该载体与核酸结合即可构建成一种新型的抗体靶向性核酸转移系统，可特异性或靶向性转移核酸进入组织细胞中。这种核酸转移系统由三部分构成：IgG抗体、SPA-PEI交联物和核酸片断，其中SPA-PEI交联物起着“桥梁”或“接头”作用，为该抗体靶向性核酸转移系统的关键组分。2015年12月～2016年6月，我们采用异型双功能交联剂N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)将SPA与PEI进行共价交联，并对所得SPA-PEI交联物的纯度、紫外光吸收峰、粒径、Zeta电位及质子缓冲能力等物理化学性质进行了观察。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料 SPA(分子量约为20 kD)、PEI(分子量为25 kD)、SPDP为Sigma公司产品；二硫苏糖醇(DTT)为广州威佳科技有限公司产品；凝胶过滤填料SephadexG75为Pharmacia公司产品。紫外可见光分光光度计(UV2201型)、粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano ZS90型)为Malvern公司产品。

1.2 SPA与PEI的化学交联采用SPDP化学偶联法，按文献[5,7]方法进行。大致步骤：①PEI-PDP、SPA-PDP的制备。将经PBS透析的 PEI或SPA按1∶2摩尔比与SPDP混合,室温下作用60 min后,经PBS透析获得纯化PEI-PDP或SPA-PDP；②PEI-PDP还原生成PEI-SH。将经0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH4.5) 透析的PEI-PDP与 DTT混合，于室温下作用30 min后同上经PBS透析，获得纯化的PEI-SH；③PEI-SH与SPA-PDP反应生成SPA-PEI交联物。将等量PEI-SH与SPA-PDP混合后于室温下搅拌22 h,获得含有SPA-PEI交联物的混合物。

1.3 SPA-PEI交联物的纯化按文献[5]方法，采用SephadexG75柱层析法进行纯化。收集合并第一峰液体即为纯化SPA-PEI交联物，将合并的液体置于透析袋中用聚乙二醇浓缩至适当体积，过滤除菌，于4℃保存。

1.4 SPA-PEI交联物的理化特性观察 ①紫外吸收峰:将SPA-PEI交联物、SPA和PEI溶于PBS溶液(pH值7.5)，终浓度分别为0.25、0.50、0.75 mg/mL,于200～400 nm波长范围内测定吸光度值(A值)，观察紫外吸收峰的波长。②纯度:采用SDS-PAGE法鉴定SPA-PEI交联物的纯度。按常规方法进行SDS-PAGE电泳、染色和脱色等。样品的处理采用非还原型和还原型方法(1 mol/L DTT作用10 min)。观察电泳条带分布。③粒径和Zeta电位:按文献[8]方法进行。将SPA-PEI交联物或PEI溶于去离子水中，配成浓度1 mg /mL，采用粒度及Zeta电位分析仪测定样品的表面电荷和粒径(重复测定3次)。④质子缓冲能力:按文献[8，9]方法，采用酸碱滴定法测定。将PEI或SPA-PEI交联物溶解于蒸馏水中，配成浓度1mg/ml溶液。以4 mol/L NaOH液调节pH至12，然后以1 mol/L HCl液滴定(每次滴加直至pH=2)；以pH计测定。

2 结果

2.1 SPA-PEI交联物的制备结果 SPA-PDP与PEI-SH的反应混合物用Sephadex G75层析柱洗脱纯化，获得3个蛋白峰，首峰是SPA-PEI交联物。

2.2 SPA-PEI交联物的理化特性 ①紫外吸收峰:SPA-PEI交联物、SPA、PEI在210 nm处有最大光吸收峰；SPA-PEI交联物、SPA在280 nm处有一小吸收峰，而PEI没有。②纯度：SPA-PEI交联物经DTT处理后行SDS-PAGE电泳，可见在分子量约20 kD处出现一蛋白条带，与单独SPA电泳条带位置一致，而未经还原剂DTT处理的SPA-PEI交联物无条带出现。提示SPA-PEI交联物纯度较高，无游离的SPA等其他组分存在。③粒径和表面Zeta电位:SPA-PEI交联物粒径为(185.0±28.5)nm，位于多数体内外转染用的转染试剂粒径范围内；表面Zeta电位为(38.0±6.6)mV，带有较强的正电荷，应能与负电荷的核酸静电结合。④质子缓冲能力:在pH 3～8范围内，PEI和SPA-PEI交联物滴定曲线均有一个明显的缓冲平台，而蒸馏水没有，提示SPA-PEI交联物和PEI具有较强缓冲能力，但PEI强于SPA-PEI交联物。

3 讨论

SPDP是一种异型双功能交联剂，具有两个活性基团：N-羟基琥珀酰亚胺基和吡啶二硫基，通过这两个基团能将具有伯氨基的化合物，如蛋白等共价交联。其原理[5,7]：SPDP通过琥珀酰亚胺基分别与蛋白质分子的伯氨基反应，引入吡啶二硫基(-PDP)，形成蛋白-PDP；将DTT等还原剂与其中之一的蛋白-PDP反应，使其吡啶二硫基被还原成-SH，生成蛋白-SH；蛋白-PDP与蛋白-SH混合发生巯基-二硫基交换而使两种蛋白质交联。SPDP交联法具有反应条件温和、反应专一、回收率高、不易发生蛋白质自身的交联、所获得的交联物活性良好等优点[5,7]。许多研究者采用SPDP作为交联剂成功地将SPA或PEI与多种活性蛋白交联，如SPA与辣根过氧化物酶(HRP)[10]、PEI与多肽[11]等交联。本项目组以SPDP为交联剂，成功地将抗体与人血清白蛋白纳米微球、SPA与多聚赖氨酸(PLL)、链球菌G蛋白(SPG)与PEI共价交联，交联物仍保持了抗体、SPA或SPG等蛋白的活性[5，12～14]。本研究也以SPDP为交联剂，成功地将SPA与PEI共价交联制备了SPA-PEI交联物。SPA-PEI交联物、SPA、PEI在210 nm处有最大光吸收峰；SPA-PEI交联物、SPA在280 nm处有一小吸收峰，而PEI没有。SPA-PEI交联物经DTT处理后行SDS-PAGE电泳，可见在分子量约20 kD处出现一蛋白条带，与单独SPA电泳条带位置一致，而未经还原剂DTT处理的SPA-PEI交联物无条带出现。提示SPA-PEI交联物纯度较高，无游离的SPA等其他组分存在。

SPA是来源于金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白，具有多种优点[5]：分子量小、易制备纯化、易保存；能与多种IgG抗体以高亲和力，非共价迅速结合，且结合过程受温度影响较小。目前SPA除用于免疫学诊断和抗体的纯化外，还用于基于抗体的亲和层析。本项目组曾将SPA与PLL共价交联，制备SPA-PLL交联物用于抗体靶向性核酸转移系统的构建，获得成功[5,6]。本研究将SPA与PEI共价交联制备了SPA-PEI交联物，希望借助PEI具有“质子海绵效应”等多种优点，以实现靶向性导入的核酸能获得更有效地转染和表达。

PEI与其他多聚阳离子聚合物相比基因表达效率更高[1～3，8,12]，本研究结果显示，PEI虽然与SPA共价结合形成SPA-PEI交联物，但该交联物的粒径、表面电荷仍与游离PEI类似，并且仍具有较强的质子缓冲能力，提示但该交联物能结合核酸片段，具有较高的转染和表达效率。

SPA-PEI交联物的抗体靶向性核酸转移系统构建具有以下特点：①以SPA为“桥”，Ab与PEI非共价结合起来，可以避免抗体的化学交联；②简便有效，节约成本,将IgG抗体与SPA-PEI交联物经简单地混合即可；③SPA-PEI交联物具通用性，易标准化。只要制备出一种SPA-PEI交联物，就可与多种IgG类的特异性抗体结合，组装多种特异性抗体-聚乙烯亚胺靶向性核酸载体。本研究既为构建抗体-PEI靶向基因载体提供实验基础，也有利于为以后的靶向性基因转染和基因治疗提供新型的非病毒型基因载体。

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