放射性脑损伤大鼠脑皮层组织中胶质原纤维酸性蛋白表达及微血管通透性观察
2016-12-27孙熠陈泊霖金学隆
孙熠,陈泊霖,金学隆
(天津医科大学,天津300070)
放射性脑损伤大鼠脑皮层组织中胶质原纤维酸性蛋白表达及微血管通透性观察
孙熠,陈泊霖,金学隆
(天津医科大学,天津300070)
目的 观察放射性脑损伤(RIBI)大鼠脑皮层胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)及微血管通透性。方法 SPF 清洁级成年健康雄性SD 大鼠48只分为A、B、C组和对照组各12只。A、B、C组采用CT大脑局部照射造成RIBI,2 Gy/次,共照射3 次,总照射剂量6 Gy。对照组仅腹腔注射麻醉大鼠,不行大脑局部照射。分别于照射7、14、28 d时取各组部分大鼠,断头处死后取脑组织,采用免疫组化法检测各组脑皮层GFAP。于照射7、14、28 d时取各组部分大鼠,断头处死后取脑组织,采用微循环显微仪观察各组损伤脑皮层微血管通透性。结果 A、B、C组和对照组的血管通透性分别为0.70±0.082、0.58±0.019、0.54±0.058、0.39±0.073,组间比较,P均<0.05。A、B、C组和对照组脑皮层GFAP的IOD值分别为145 006±5 266.8、101 250±9 034.8、68 313±7 633.4、17 617±5 870.7,组间比较,P均<0.05。结论 RIBI大鼠损伤脑皮层存在GFAP高表达,GFAP的表达水平与微血管通透性的变化趋势相一致,GFAP可能参与了RIBI的发生发展。
放射性脑损伤;胶质原纤维酸性蛋白;微血管通透性;动物实验
放射性脑损伤(RIBI)是γ放射疗法的严重并发症,严重降低患者生存质量。目前临床尚无有效治疗方法治疗RIBI,对于脑损伤的病情的判断、损伤程度及预后诊断则是治疗脑损伤的关键。星形胶质细胞(Ast)是中枢系统重要的胶质细胞[1],星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)作为星形胶质细胞的一种骨架蛋白,被公认为是星形胶质细胞的特征性标志物[2],在维持细胞形态结构的稳定、参与突起形成与生长等方面具有重要作用[3~5]。目前关于GFAP表达及血管通透性变化来评估放射线导致的脑损伤程度的相关报道较少。2015年1~6月,我们观察了RIBI大鼠脑皮层GFAP及微血管通透性的表达变化,现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物、试剂及仪器 选用SPF 清洁级成年健康雄性SD 大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)48只,体质量210~230 g。实验前大鼠在室温22 ℃~25 ℃、40%~70%恒定湿度条件下,自由摄食和饮水,按照自然昼夜节律采光,适应性饲养一周。本研究所用免疫组化试剂购自武汉博士德生物工程有限公司,微循环显微仪购自徐州鑫光光学仪器有限公司。
1.2 大鼠分组及RIBI模型制作方法 将48只大鼠随机分为A、B、C组和对照组各12只。A、B、C组采用CT照射方法制作RIBI模型。大鼠常规饲养、过夜禁食后20%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠,将大鼠俯卧位固定于特制铅模具内,暴露照射区域,采用CT进行大脑局部照射。照射区域为大鼠冠状缝与人字缝之间的特定区域(如图1,上至大鼠两眼角连线下至双耳连线),用铅膜遮挡身体其他非照射部位。照射剂量2 Gy/次,共照射3 次,总照射剂量6 Gy。对照组仅20%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠,不行大脑局部照射。
图1 RIBI大鼠CT照射区域
1.3 各组大鼠损伤脑皮层微血管通透性观察 A、B、C组分别于照射第7、14、28 天时取大鼠各6只,对照组于麻醉后第7天取6只大鼠对比观察, 20%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉,于观察前1 h经尾静脉按3 mL/kg的剂量注射2%伊文思蓝(EB)。用牙科打磨钻将大鼠颅骨磨开直径约为4 mm 的圆形骨窗,除去硬脑膜,暴露出脑皮质血管。采用微循环显微仪观察各组大鼠损伤脑皮层血管通透性。应用Image Pro Plus5.0专业医学图像分析软件检测血管内外EB染色的累积光密度值(IOD)并将血管外EB染色的IOD值与血管内外IOD值总和之比表示血管通透性。实验共重复3次,取平均值。
1.4 各组大鼠损伤脑皮层GFAP检测 采用免疫组化染色法。分A、B、C组分别于照射第7、14、28 天时取大鼠各6只,对照组于麻醉后第7天取6只大鼠麻醉后断头取脑组织包埋、切6 μm片。PBS 冲洗3 次,置于0.01 mmol/L 枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中行抗原修复,待冷却至室温后PBS 冲洗3次,5%BSA于37 ℃下封闭30 min,后加小鼠抗大鼠GFAP(1∶500) ,4 ℃过夜;37 ℃复温45 min,PBS 冲洗,加山羊抗小鼠IgG 137 ℃孵育30 min,PBS 冲洗,滴加链酶亲和素-过氧化物酶复合物,37 ℃孵育30 min,PBS 冲洗,DAB显色,Mayer′s苏木素复染,梯度酒精脱水、透明,中性树胶封片。采用Nikon Ti-U倒置显微镜下观察各组大鼠损伤脑皮层GFAP。每张切片各选取5个相邻不重叠的高倍视野,用Image Pro Plus5.0专业医学图像分析软件检测每个视野GFAP免疫组织化学阳性染色并计算出GFAP免疫组化染色的累计光密度值(IOD),实验共重复3次,取平均值。
2 结果
2.1 各组大鼠损伤脑皮层微血管通透性比较A、B、C组和对照组的血管通透性分别为0.70±0.082、0.58±0.019、0.54±0.058、0.39±0.073,组间比较,P均<0.05。
2.2 各组大鼠损伤脑皮层GFAP表达比较A、B、C组和对照组脑皮层GFAP的IOD值分别为145 006±5 266.8、101 250±9 034.8、68 313±7 633.4、17 617±5 870.7,组间比较,P均<0.05。
3 讨论
RIBI是部分或者全脑脑组织在接受到放射线照射,在多种不同因素的联合作用下导致神经元变性坏死而引发的中枢神经系统疾病,是脑部肿瘤患者接受放射治疗后所最严重的后遗症之一,严重影响患者的生存时间和生活质量,且一旦发生不可逆转[6]。
研究发现,血管损伤在RIBI的发生发展中起重要作用[7]。放射可导致血管通透性升高、血脑屏障(BBB)破坏、血管周围水肿,从而影响脑局部血流及能量供应,加速脑组织的液化坏死。BBB完整性对维持中枢神经系统稳态和神经元正常功能起着重要的作用[8]。正常生理条件下,脑细胞的水平衡主要依靠血管内的电解质、血浆蛋白形成的渗透压梯度及BBB的屏障功能来维持,当BBB的结构受到破坏时,血管的通透性增加,血浆蛋白等大分子继而从血管中溢出,从而导致脑水肿的发生,随后即可引起一系列的脑功能障碍。
GFAP生理状态下可自发聚合成星形细胞纤维[9],主要表达于中枢神经系统的星形胶质细胞,作为细胞骨架的组成成分其在维持细胞张力强度中起到调节作用。GFAP的表达受多种因素影响,包括生理条件及病理条件,各种中枢神经系统损伤均可引起星形胶质细胞GFAP表达变化[10,11]。
本研究中, 我们运用外源性EB作为示踪剂检测RIBI大鼠血管的通透性。通过对血管内外EB渗出量的对分析评价BBB通透性的改变。首先我们使用微循环显微仪观察损伤区大脑表面微血管的改变,发现对照组EB局限于血管内部,RIBI大鼠血管内EB渗透至血管外脑组织。说明RIBI模型制作成功。研究表明,中枢神经系统在受放射线照射后诱发的脑损伤可引起GFAP的反应[12],表现为星形胶质细胞增生与肥大,以GFAP增高作为其特征性标志[13]。Hasegawa等[14]发现移植人类胶质细胞瘤的裸鼠经射线照射后,GFAP阳性细胞数量明显增多。RIBI后GFAP增高的机制较为复杂,尤其是在脑损伤后,在远离损伤区的脑组织内也可以检测到GFAP水平的一过性增高[15],同时可知BBB受到破坏,由此推断出GFAP的变化与BBB的损伤存在直接的关系。作为BBB的组成成分,星形胶质细胞伸出的足样投射几乎将BBB的毛细血管完全包绕,其在维持BBB的功能方面发挥重要作用[16],星形胶质细胞的凋亡、足突空泡化,这一变化必然导致BBB结构的破坏,进而影响BBB的功能,使得BB通透性增高而引起脑水肿的发生。
本研究结果显示,RIBI大鼠脑组织GFAP表达升高、BBB通透性增高,且随照射时间延长,GFAP表达逐渐降低。这些变化说明GFAP对维持BBB功能的完整性具有重要作用,其可以成为RIBI损伤、修复过程中的敏感指标。其可能原因为:GFAP作为一种特异性中间丝蛋白,表达于发育成熟的星形胶质细胞中,星形胶质细胞广泛分布于中枢神经系统中,其与神经元以及脑内毛细血管密切相关,在维持脑内微循环的稳定性上发挥着重要的作用。GFAP作为星形胶质细胞的一种特异性蛋白,其对胶质细胞的损伤以及脑损伤均有着高度的敏感性和特异性。
综上所述,RIBI大鼠损伤脑皮层存在GFAP高表达,GFAP的表达水平与微血管通透性的变化趋势相一致,GFAP可能参与了RIBI的发生发展。
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Changes of capillary permeability and GFAP expression after radiation-induced brain injury in rats
SUNYi,CHENBolin,JINXuelong
(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)
Objective To observe the dynamic changes of capillary permeability and the expression of glial fibrillary acid protein (GFAP) in cerebral cortex after radiation-induced brain injury (RIBI) in rats. Methods Forty-eight adult male healthy SD rats were randomly divided into groups A, B, C and the control group, 12 in each. RIBI models of groups A, B and C were established by CT scanning with a whole dose of 6 Gy, 2 Gy/time for 3 times. Animals in the control group were subjected to the same surgical procedure without cranial irradiation. The expression of GFAP in the parietal cortex was analyzed at different time points (7, 14 and 28 h) by immunohistochemistry (IHC), and the capillary permeability was evaluated by microscope vascular camera device and microcirculation video recording system. Results The capillary permeability in the groups A, B and C was 0.70±0.082, 0.58±0.019, 0.54±0.058 and 0.39±0.073, which was significantly higher than that in the control group (0.39±0.073) (allP<0.05). Similarly, IHC indicated that the expression levels of GFAP in the groups A, B, C were 145 006±5 266.8, 101 250±9 034.8 and 68 313±7 633.4, which were significantly higher as compared with that of the control group (17 617±5 870.7), (allP<0.05). Conclusion The level of GFAP is high in the brain cortex of RIBI rats, which is consistent with the change of capillary permeability after RIBI, and this strongly indicates that GFAP may participate the occurrence and development of RIBI.
radiation-induced brain injury; glial fibrillary acid protein; capillary permeability; animal experiment
国家科技计划项目国际科技合作专项子项目(2011DFA30550)。
孙熠(1983-),男,硕士研究生在读,研究方向为生理学。E-mail: becksun1031@163.com
简介:金学隆(1964-),男,博士,教授,研究方向为脑细胞移植、脑机能可视化、脑微循环。E-mail: econversation@163.com
10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.006
R651.1
A
1002-266X(2016)39-0020-03
2016-02-16)