雷帕霉素在神经修复方面作用机制的研究进展

殷悦涵 孙丽颖 田文

雷帕霉素是由放线菌产生的31元大环产物[1]，最初是在抗真菌药物的筛选中于复活岛采集的细菌中发现[2]。研究表明，雷帕霉素具有免疫抑制[3]、抗肿瘤[4]、神经保护/神经再生和延长寿命的作用[5-6]。雷帕霉素通过与其细胞内受体FK506结合蛋白12(FKBP12)结合，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( mammalian target of rapamycin，mTOR)。结合形成的FKBP12-雷帕霉素复合物直接与mTOR上的FKBP12-雷帕霉素-结合域(FKBP12-rapamycin-binding，FRB)相互作用；该FRB结构域属于磷酸肌醇激酶相关激酶家族[7]。一旦FKBP12-雷帕霉素复合物结合至FRB结构域，将会抑制mTOR的活性，而mTOR与哺乳动物体内的多种蛋白质结合，在细胞生命中起着重要作用。自首次分离雷帕霉素以来，许多研究人员都对雷帕霉素的生物合成途径进行了研究。研究发现，启动剂(4R,5R)-4,5-二羟基环己酮-1-烯羧酸(DHCHC)启动了雷帕霉素的生物合成，雷帕霉素聚酮合酶(PKS)利用扩展基(2S)-丙二酰辅酶a或(2S)-甲基丙二酰辅酶a进行缩合反应，形成一个新生的聚酮链。当聚酮链的延伸终止后，一个来源于赖氨酸的哌啶酸基，在RapL编码的赖氨酸环化脱氨酶的作用下，合成至该聚酮链上。之后，在RapP肽合成酶催化的环化作用下，形成前雷帕霉素[8-9]。最终，PKS后修饰酶催化合成雷帕霉素。现对雷帕霉素的发现及其多种生物学作用、人类mTORC1受体结合至FKBP12-雷帕霉素复合物的最新研究进展、雷帕霉素的生物合成及调控、雷帕霉素类似物的生成及生物学效应、雷帕霉素的药代动力学以及其在神经修复中的作用和该药物的应用前景进行展望。

1.雷帕霉素及其类似物的发现及生物活性:雷帕霉素是在阿耶斯特实验室，从在复活节岛采集的植物和土壤标本中分离得出，为链霉菌产生的天然产物[2]。该化合物对包括白色念珠菌在内的人类致病性酵母菌表现出强大的活性。雷帕霉素作为抗真菌药物发现于1975年[2]，并于同年获得美国专利(US392999A)[10]。此后研究发现，雷帕霉素及其类似物对几种真菌的生长具有抑制作用，包括新型隐球菌、假丝酵母菌和青霉菌属[11]。另有研究表明，雷帕霉素在体外抑制了机会获得性真菌病原体--毛霉菌的生长，该菌导致的感染病死率高达65%～90%[12]。还有研究表明，雷帕霉素的抗真菌活性受到依赖于FKBP12-雷帕霉素复合物的酵母Tor激酶的负性调节[13]。

尽管雷帕霉素最初被认为是一种抗真菌药物，阿耶斯特实验室的研究人员发现它有强大的免疫抑制活性[3]。在最初的动物实验中，雷帕霉素抑制了大鼠的免疫反应，阻止了实验预期的免疫性疾病(变应性脑脊髓炎和非特异性关节炎)的发生和类IgE抗体的形成[3]。在器官移植动物模型中，它还抑制了细胞免疫反应和同种异体移植排斥反应[14]。上述发现使雷帕霉素应用于器官移植的免疫治疗。此外，雷帕霉素作为免疫抑制剂，相比于环孢素A，它效用更高(高达100倍)且毒性更小[15]。雷帕霉素不仅抑制急性器官排斥反应，还抑制了慢性器官排斥反应，而他克莫司和环孢素A则不具备后述功能[16]。雷帕霉素对心脏移植患者的治疗也同样有效，并显著减少了死亡、发生心肌梗死和因心脏问题住院的患者数[17]。雷帕霉素也可与其他免疫制剂联用，它与环孢素联用能显著降低肾毒性和急性肾移植排斥反应的发生率[16]。雷帕霉素作为一种免疫制剂分别在美国和欧洲被批准使用。

除了抗真菌和免疫抑制活性以外，研究发现雷帕霉素及其类似物还有抗恶性肿瘤的功能[18]。早期试验发现了雷帕霉素有抗脑肿瘤及结肠肿瘤的效果，而在后续的细胞实验中，雷帕霉素与其他药物联用发挥了强有效的抗癌作用。在体外实验中，雷帕霉素与顺铂联用抑制了多种癌细胞的生长，包括Ishikawa细胞、ECC-1细胞[19]、宫颈癌Hela细胞[20]。雷帕霉素与紫杉醇联用抑制了Ishikawa细胞和ECC-1细胞增殖，相比单用紫杉醇，二者联用增加了促进其细胞凋亡的作用，而单独应用雷帕霉素并不能诱导细胞凋亡[21]。此外，第二代半合成雷帕霉素衍生物：替西罗莫司、伊维莫司、地磷莫司，相比于雷帕霉素，有更强的药代动力学特性，并已被FDA批准或用于临床试验。

还有研究表明雷帕霉素具有其他的生物活性，包括神经保护/神经再生和延长寿命。雷帕霉素在神经退行性疾病的治疗模型中，均被报道可减弱泛素化蛋白聚集、减缓神经元丢失[22]，为预防帕金森病等与错误折叠/聚集蛋白相关的疾病提供了一种思路[5]。此外，半合成的雷帕霉素类似物也显示出促进神经元存活和刺激神经突生长的作用，并提出雷帕霉素的神经保护活性可能与FKBP52介导有关[23]。

2.雷帕霉素的作用机制：雷帕霉素通过与FKBP12结合，抑制mTOR的功能，从而实现其免疫抑制作用[24]。最初的分子遗传研究学认为，FKBP12-雷帕霉素复合物为细胞内分子，作用于某一靶位以抑制细胞生长。随后的研究则观察到，无论是TOR1突变、或是TOR2突变，FKBP12-雷帕霉素复合物均不能结合至TOR，说明TOR本身即是雷帕霉素的靶点[25]。

研究人员发现了与S.酿酒酵母TOR同源的哺乳动物TOR(mTOR)[26]，并且具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。mTOR内含HEAT结构域(亨廷顿蛋白、延伸因子3、PR65/A、TOR)，HEAT结构域于其氮端重复，之后是FAT结构域(FRAP、ATM、TRRAP)、FRB结构域、激酶结构域、FATC端(FAT-碳-羧基端)、碳端[27]。mTOR存在于两个结构和功能不同的复合物中，mTOR复合物1 (mTORC1)和mTOR复合物2 (mTORC2)。mTORC1对雷帕霉素敏感，由哺乳动物同族蛋白mLST8[28]、PRAS40[29]、Deptor[30]、Raptor[31]，以及mTOR组成。与之相反，mTORC2由生长因子介导的PI3K激活，包括mTOR、mLST8、Deptor、mSIN、Rictor、Protor[32]。最初的研究认为mTORC2对雷帕霉素不敏感，因其暴露于雷帕霉素时，不会立刻受到调节作用[33]。然而，后续研究证实，雷帕霉素的慢性治疗可以破坏一些癌细胞和正常肝脏、肌肉、脂肪组织中的mTORC2[34]。

mTOR与Raptor、mLST8、Deptor、PRAS40均为mTORC1的催化亚基。Raptor为多区域蛋白，由Raptor氮端保守域、中间部分的HEAT重复区域、WD40重复域组成[31]。Raptor是一种结构蛋白，它控制着mTORC1复合物的组装并确保其对底物的专一性。Deptor和PRAS40是mTORC1的负调控因子[30]，mLST8可以激活mTOR的激酶活性、并稳定其活性位点[35]。低温电子显微镜首次揭露了mTORC1的组织结构。mTORC1是一种专性二聚体，呈空心菱形。随着高分辨率低温电子显微镜的应用，研究发现，mTOR的氮端HEAT结构域包含2个α螺旋[36]。HEAT结构域互相包裹，第一个HEAT结构域锁定于相邻的FAT结构域，形成二聚体。低温电镜结构表明，Raptor限制了活性位点，而FKBP12-雷帕霉素复合物在结构上进一步减少了该活性位点的缝隙，说明mTOR的调节机制是控制底物通路发挥作用[35]。此外，还有研究结果表明Raptor直接参与了mTORC1底物的选择和传递。

虽然有着类似的免疫抑制活性，雷帕霉素和他克莫司、环孢素A的作用机制并不相同。他克莫司和环孢素通过阻断钙调神经素，阻断T细胞中白介素-2基因转录激活的信号通路，从而阻断T细胞受体的信号通路，抑制了IL-2的产生及T细胞的增殖[18]。而雷帕霉素通过与FKBP12结合，中断了T细胞活化的第二阶段[37]。FKBP12 -雷帕霉素复合物与mTOR相互作用，产生的FKBP12-雷帕霉素-mTOR复合物干扰了IL-2受体与其他细胞因子、生长因子受体的通路。因此，它抑制T细胞细胞周期中G1期到S期的进展，从而抑制T-细胞增殖[38]。

3.生物合成及调控：启动单元DHCHC结合至雷帕霉素PKS雷帕霉素域，启动了雷帕霉素的生物合成。研究证实DHCHC是由分支酸在RapK的作用下水解形成。最近的一项体外实验用纯化的RapK及其类似物FkbO证实，分支酸形成DHCHC的第一步是雷帕霉素基因簇在RapK的作用下活化[39]。一旦启动单元DHCHC结合至RapA，其中的烯酰还原酶会将其分解[40]；之后，在PKS酶RapA、RapB、RapC等亚基的催化作用下，DHCHC复合物与2S-丙二酰辅酶A或2S-甲基丙二酰辅酶A结合，形成具有环状结构的聚酮化合物[8]。随后，赖氨酸在RapL的作用下合成的甲基哌啶，插入至该聚酮链中，在RapP的作用下进行环化[41]。

通过基因和生物转化的实验，明确了在雷帕霉素生物合成的PKS后修饰中所发挥作用的其他基因[9]。PKS后剪切酶在前雷帕霉素形成雷帕霉素的过程中，催化了其氧化和甲基化。研究推测，甲基转移酶RapM、RapQ、RapI分别催化C16、C27、C39位点上羟基的甲基化；RapJ、RapN分别催化雷帕霉素中间体C9、C27位点的特异性氧化，最终在铁氧还原蛋白RapO的催化作用下形成雷帕霉素[8-9]。

对雷帕霉素基因簇的分析发现了雷帕霉素PKS酶以外的5种调节蛋白。据报道，RapG和RapH具有DNA结合位点，与转录激活因子有相似的序列[42]。而在野生菌株中引入额外的RapG或RapH序列，雷帕霉素的产量显著增加。基因敲除和再补充实验发现，RapG在雷帕霉素的生物合成中起着关键作用，RapH起着支持作用[42]。而RapR和RapS共同作用于蛋白翻译，被认为是负调控基因。最近，RapR、RapS和RapY在雷帕霉素生产中的负调控作用通过对其进行过表达、敲除和敲除后再添加实验得到了证实[43]。野生型和突变株的转录分析表明，RapS和RapY对雷帕霉素大部分生物合成基因的表达具有负调控作用。此外，RapS被发现能够抑制RapY的表达，进而抑制RapX编码的转运蛋白的表达，说明RapS和RapY在雷帕霉素的生物合成中起着关键作用[43]。

4.雷帕霉素的药代动力学：雷帕霉素的绝对生物利用度尚不明确。有小样本研究显示，血液透析患者通过静脉注射药物，与口服类似剂量的稳定肾移植患者的吸收浓度相比，口服药物的生物利用度约为15%[44]。在人体全血中，雷帕霉素主要分布于红细胞(94.5%)、血浆(3.1%)、淋巴细胞(1.01%)和粒细胞(1.0%)，其分布与温度和浓度无关[45]。36例接受单次口服雷帕霉素的稳定肾移植患者的平均血液-血浆浓度比为34.5:1，具有显著的个体间变异性(CV 52.3%，范围为10-70)[46]。雷帕霉素在脂蛋白中的分布尚不明确，但已知雷帕霉素的代谢作用增加了高、低、极低密度脂蛋白的含量。在60%的游离成分中，只有一小部分(约4%)与可溶性血浆蛋白结合[45]。因此，全血细胞监测可作为雷帕霉素的治疗性用药监测。由于其疏水性，雷帕霉素广泛分布于人体组织的脂膜和红细胞中，具有较大的表观分布体积(5.6～16.7L/kg)[45]。经静脉或口服给药14 d后，脾、肾、肝、肠和心脏中均有较高分配系数。

雷帕霉素在P-糖蛋白和CYP3A4细胞色素P450家族中A亚家族的第4位的作用下代谢消除。一项16例的肾移植患者的临床研究表明，在接受单次雷帕霉素和环孢素、强的松治疗时，表观清除率有8倍的差异(0.042～0.339 L·h-1·kg-1)，终末半衰期为43.8～86.5 h。另一项40例稳定肾移植患者的临床研究中，受试者接受了疗程为14 d的雷帕霉素、环孢素和强的松 的联合使用，表观清除率有4.5倍的差异[平均为(0.210(0.090～0.416)L·h-1·kg-1]，终末半衰期为(62±12)h[46]。根据放射性物质研究方法推测，雷帕霉素代谢产物的主要清除途径为胆道(91%)，而在尿液中则有2.2%。肝功能异常导致雷帕霉素及其代谢物浓度升高。

影响P-糖蛋白和CYP3A4的浓度或活性的药物，会影响雷帕霉素的药代动力学。地尔硫卓和酮康唑分别使雷帕霉素的AUC升高了60%和90% ，而利福霉素使其AUC降低了82%[47]。该方面的药物相互作用仍有待进一步研究。

5.雷帕霉素在神经修复中的作用:雷帕霉素的神经保护/神经再生作用早已有研究证明，但其具体机制尚不明确。在脊髓缺血模型中，应用雷帕霉素治疗减少了病变部位的反应性胶质增生[48]。Akira等[49]的研究表明，在小鼠脊髓损伤急性期，雷帕霉素对mTOR的抑制作用显著降低了神经组织的损伤和运动障碍，减少并发症的发生，该研究为脊髓损伤的治疗提供新的策略。

近年来，越来越多的动物研究证实雷帕霉素及mTOR在中枢神经系统,尤其是脊髓损伤的相关研究中发挥着重要作用。Soraya等[50]的研究表明，雷帕霉素通过抑制mTOR，减少了神经的退行性变，并使IL-1β、IL-6、TNF-α的生成减少；低剂量的雷帕霉素也能使IL-10增加，阻止喹啉酸诱导的星形胶质细胞的减少，从而预防喹啉酸引起的运动障碍。曹富江等[51]的研究发现，抑制miRNA-99b-5p信号通路，可以减弱小鼠脊髓损伤引起的脊髓神经元的有害改变，而miRNA-99b-5p的靶点可能为mTOR，这一研究也为雷帕霉素在该领域的应用提供了新的思路。

mTOR是细胞增殖、分化、成熟的重要调节因子，雷帕霉素通过与FKBP12结合，抑制mTOR的功能，从而抑制该通路下游的一系列生理功能，从而发挥药理作用。目前对mTOR通路的研究较为成熟，雷帕霉素的作用靶点也已明确。随着分子生物学研究的进展，越来越多的疾病和mTOR通路的重要联系浮出水面；而随着基因检测技术的发展，越来越多的mTOR通路异常所致的疾病能够被精确检测。目前，雷帕霉素作为肾移植的免疫抑制剂，是一种成熟、安全的治疗措施，但这只是雷帕霉素应用的冰山一角，其更广泛的应用仍需更多的研究进行挖掘。