Mcl-1基因siRNA囊泡制备及其对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用观察

王绍军，郭思彤，吴闯，赵赶

(1广西壮族自治区妇幼保健院，南宁 530003；2 广西壮族自治区人民医院；3广西医科大学药学院)



Mcl-1基因siRNA囊泡制备及其对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用观察

王绍军1，郭思彤2，吴闯3，赵赶1

(1广西壮族自治区妇幼保健院，南宁 530003；2 广西壮族自治区人民医院；3广西医科大学药学院)

目的 制备包载髓样细胞白血病1(Mcl-1)基因的小干扰RNA(siRNA)囊泡(Mcl-1基因siRNA囊泡)，并观察其对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用。方法 ①Mcl-1基因siRNA囊泡制备及其功能鉴定：采用乙醇注入法制备空白囊泡，将其分别和FAM标记(荧光标记物，可在显微镜下被观察)的正常siRNA(FAM-siRNA)、Mcl-1 基因siRNA溶液涡旋、静电复合，室温静置30 min，获得包载FAM-siRNA囊泡、Mcl-1基因siRNA囊泡。采用马尔文激光粒度仪测定空白囊泡、包载FAM-siRNA囊泡的平均粒径和zeta电位；采用超滤离心-荧光分光光度法测定包载FAM-siRNA囊泡的荧光强度并计算包封率；观察FAM-siRNA释放情况，计算FAM- siRNA释放率。取HepG2细胞分为A、B、C、D组，培养24 h时C组加入包载FAM- siRNA囊泡，D组加入包载FAM-siRNA囊泡和Lipofectamin转染试剂，B组加入游离FAM-siRNA，A组不做任何处理，继续培养6 h时观察各组细胞FAM- siRNA摄取情况。②转染Mcl-1基因siRNA囊泡对HepG2细胞的生长抑制作用观察：取HepG2细胞，分为1、2、3、4、5组，5×105/孔接种于6孔板，每组3个复孔。培养24 h时1、2、3、4组分别加入游离Mcl-1 siRNA、包载FAM- siRNA囊泡、Mcl-1基因siRNA囊泡、Mcl-1基因siRNA +Lipofectamin转染试剂，5组不做任何处理。培养78 h时检测各组细胞Mcl-1蛋白。取HepG2细胞分为甲、乙、丙、丁组及对照组，培养24 h时甲、乙、丙、丁组分别加入终浓度为1、10、50、100、200 nmol/L的游离Mcl-1 基因siRNA、包载FAM- siRNA囊泡、Mcl-1基因siRNA囊泡、Mcl-1基因siRNA+ Lipofectamin转染试剂,对照组不做任何处理。培养48 h时观察各组细胞生存情况，计算细胞存活率。结果 空白囊泡、包载FAM- siRNA囊泡粒径、zeta电位相比，P均<0.01。包载FAM- siRNA囊泡包封率82.3%±2.1%。培养1、3、6、12、24、36、48、72、96 h时FAM- siRNA囊泡的FAM-siRNA释放率分别为13.5%±2.8%、26.1%±1.6%、38.0%±2.9%、50.6%±2.3%、56.8%±2.9%、59.9%±2.3%、63.3%±2.0%、65.0%±2.7%、67.2%±2.9%。C、D组对FAM-siRNA摄取情况优于B组。1、2、3、4、5组细胞Mcl-1蛋白相对表达量分别102.0±4.9、103.8±8.3、25.2±3.7、29.4±6.4、96.1±5.8，3组Mcl-1蛋白相对表达量明显低于1、2、5组，P均<0.01。当转染浓度为100 nmol/L时，丙、丁组细胞生存率均高于甲、乙组，P均<0.01；丁组细胞生存率高于丙组，P<0.01。结论 成功制备Mcl-1基因siRNA囊泡。HepG2细胞中Mcl-1蛋白低表达。转染Mcl-1基因siRNA囊泡的HepG2细胞存在生长抑制。

髓样细胞白血病1；小干扰RNA；RNA干扰；囊泡；肝癌；细胞存活率

髓样细胞白血病1(Mcl-1)基因是Bcl-2抗凋亡基因家族的成员之一，在肿瘤细胞的凋亡、增殖、分化等过程具有重要作用[1]。Mcl-1蛋白在肝癌[2]、乳腺癌[3]、胰腺癌[4]和白血病[5,6]等恶性肿瘤组织中中均有表达，降低其在肿瘤细胞中的表达可能成为治疗肿瘤疾病的有效途径之一。小干扰RNA(siRNA)常被用于介导RNA干扰一种新型SiRNA载体[7,8]，但非特异性分布、细胞穿透性差、易被细胞内酶降解等特性限制了其应用范围[6]。目前国内尚未有文献报道将囊泡用于Mcl-1基因 siRNA的递送。2010年1月～2016年4月，我们制备了包载Mcl-1基因的siRNA囊泡(Mcl-1基因siRNA囊泡)，并观察其对人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 HepG2细胞[2]来源于美国ATCC细胞库，置于含10%胎牛血清(PBS)的DMEM培养液、5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。Mcl-1 siRNA(上游引物5′-AAGUAUCACAGACGUUCUCTT-3′，下游引物5′-GAGAACGUCUGUGAUACUUTT-3′)，FAM(荧光标记物，可在显微镜下被观察)标记的阴性对照 siRNA(FAM-siRNA)均购自上海吉玛公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 包载FAM-siRNA囊泡、Mcl-1 基因siRNA囊泡制备方法 采用乙醇注入法制备空白囊泡[9]，分别称取50 mg DOTAP、50 mg司盘-60、100 mg胆固醇溶于10 mL无水乙醇中，将上述溶液以1.0 mL/min注入50 mL PBS(50 ℃，pH=7．4)中，不停搅拌直至乙醇挥发完全。待冷却至室温后继续搅拌30 min，控制终体积为100 mL，将所得混悬液依次过0.45 μm和0.22 μm的微孔滤膜后得空白囊泡。将10 μL浓度为20 μmol/L的FAM-siRNA、Mcl-1 siRNA分别与1 mL空白囊泡溶液涡旋，室温静置30 min。

1.3 包载FAM-siRNA囊泡功能观测方法

1.3.1 包载FAM-siRNA囊泡粒径及zeta电位测定方法 采用马尔文激光粒度仪测定空白囊泡、包载FAM-siRNA囊泡平均粒径和zeta电位，取样品用蒸馏水稀释10倍，设定激光束波长为633 nm,入射光与散射光夹角为90°，平衡120 s。所有操作均严格按照使用说明书进行。实验重复3次，取平均值。

1.3.2 FAM-siRNA囊泡包封率测定方法 取包载FAM-siRNA囊泡1 mL，5 000 r/min离心10 min，取滤液加甲醇定容至5 mL，激发波长480 nm。发射波长520 nm条件下测其荧光强度F1。另外取制剂相同量的FAM-siRNA加甲醇定容至5 mL后测其荧光强度F2。计算包载FAM-siRNA囊泡的包封率。包封率=(1-F1/F2)×100%。实验重复3次，取平均值。

1.3.3 包载FAM-siRNA囊泡的FAM-siRNA释放情况观测 取包载FAM-siRNA囊泡1 mL，5 000 r/min离心10 min，将样品转移至4 mL pH为7.4的PBS中，37 ℃摇床振荡，将释放介质分离至超滤离心管中，5 000 r/min离心10 min后回收滤液。采用荧光分光光度法观察释放1、3、6、12、24、36、48、72、96 h 时FAM-siRNA释放情况，计算FAM-siRNA释放率。释放率=(药物释放量/药物总量)×100%。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 HepG2细胞对包载FAM-siRNA囊泡、游离FAM-siRNA摄取情况观察 取对数生长期HepG2细胞，分为A、B、C、D组，1×104/孔接种于96孔板，每组3个复孔。培养24 h时取C、D组分别加入包载FAM-siRNA囊泡和包载FAM- siRNA的Lipofectamin转染试剂(制作方法同1.2)，B组加入等量游离FAM-siRNA，A组不做任何处理，其中每孔FAM-siRNA终浓度为100 nmol/L。共培养6 h后弃上清，PBS清洗细胞2次，加入胰酶消化收集细胞，1 000 r/min离心5 min，吸弃上清，加入500 μL PBS重悬细胞，过200目筛网后上机检测各组细胞FAM-siRNA摄取情况。

1.4 转染Mcl-1基因siRNA囊泡对HepG2细胞的生长抑制作用观察

1.4.1 转染Mcl-1基因siRNA囊泡对HepG2细胞Mcl-1蛋白的影响 取对数生长期HepG2细胞，分为1、2、3、4、5组，5×105/孔接种于6孔板，每组3个复孔。设1、2、3、4组，培养24 h时分别加入终浓度为100 nmol/L游离Mcl-1-siRNA、包载FAM-siRNA囊泡、包载Mcl-1-siRNA囊泡、包载Mcl-1基因siRNA+Lipofectamin转染试剂，5组不做任何处理。转染6 h后吸弃培养液，加入含血清DMEM培养72 h后收集各组细胞，采用Western blotting法检测Mcl-1蛋白。以β-actin作为内参，以Mcl-1蛋白条带与β-actin条带灰度值之比表示Mcl-1蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4.2 转染包载Mcl-1基因siRNA的囊泡对HepG2细胞的生长抑制作用观察 采用MTT法。取对数生长期HepG2细胞，分为甲、乙、丙、丁组及对照组，1×104/孔接种于96孔板，每组3个复孔。培养24 h时甲、乙、丙、丁组分别加入终浓度为1、10、50、100、200 nmol/L的游离Mcl-1 siRNA、包载FAM-siRNA囊泡、包载Mcl-1基因siRNA囊泡、包载Mcl-1基因siRNA+Lipofectamin转染试剂，对照组不做任何处理。培养6 h吸弃上清液，加入含血清DMEM继续培养48 h，加入20 μL MTT继续孵育4 h，吸弃上清液，加入150 μL DMSO，避光震荡5 min，采用多功能酶标仪测定各组490 nm处吸光度值(A值)，计算细胞生存率。细胞生存率(%)=(A观察组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。实验重复3次，取平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料采用表示，结果比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 包载FAM-siRNA囊泡粒径、zeta电位、包封率、释放率及摄取率 空白囊泡、包载FAM-siRNA囊泡粒径分别为(159.0±2.4)、(193.4±2.7)nm，二者比较，P<0.01。空白囊泡、包载FAM-siRNA囊泡zeta电位分别为(51.9±1.2)、(38.4±1.9)mV，二者比较，P<0.01。包载FAM-siRNA囊泡包封率(82.3±2.1)%。释放1、3、6、12、24、36、48、72、96h包载FAM-siRNA囊泡的FAM-siRNA释放率分别为13.5%±2.8%、26.1%±1.6%、38.0%±2.9%、50.6%±2.3%、56.8%±2.9%、59.9%±2.3%、63.3%±2.0%、65.0%±2.7%、67.2%±2.9%。B、C、D组FAM-siRNA摄取情况见图1。C、D组对FAM-siRNA摄取情况优于B组。

图1 各组FAM-siRNA摄取情况

2.2 转染Mcl-1基因siRNA囊泡的HepG2细胞的Mcl-1蛋白表达及细胞生存率 1、2、3、4、5组细胞Mcl-1蛋白的相对表达量分别为102.0±4.9、103.8±8.3、25.2±3.7、29.4±6.4、96.1±5.8,3组Mcl-1蛋白的相对表达量明显高于1、2、5组，P均<0.01。各组转染不同浓度Mcl-1基因SiRNA囊泡的HepG2细胞生存率比较见表1。

3 讨论

Mcl-1蛋白是一种抗凋亡蛋白，其在细胞系分化、细胞凋亡、细胞分化及细胞周期的调控中起重要作用[6]。但也有研究[11,12]发现，当细胞接收凋亡信号刺激后，另外一些BH3-only蛋白如Noxa蛋白，可竞争性结合Mcl-1蛋白，促进细胞释放Bak促凋亡蛋白，导致线粒体外膜上形成孔道并释放细胞色素C，从而引起后续半胱天冬酶级联反应，最终导致细胞凋亡[4]。Mcl-1蛋白的表达受到转录、翻译等多水平调节。研究[13]表明，许多肿瘤细胞能过度表达Mcl-1蛋白，导致抗凋亡成员与促凋亡成员之间的相互作用失衡，引发肿瘤细胞恶性增殖。除了抗凋亡功能之外，也有研究认为Mcl-1蛋白分布于细胞核内，可与细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK-1)和增殖细胞核抗原(PCNA)相互作用，调控细胞分化与细胞周期进程。进一步研究[8，10]表明,Mcl-1蛋白在胚胎形成、组织发育和免疫系统中具有重要作用,Mcl-1表达异常可以导致恶性肿瘤的发生。最新研究[11]认为，Mcl-1蛋白其异常表达可以抑制肿瘤细胞的正常凋亡，从而导致肿瘤细胞多药耐药的产生。

表1 各组转染不同浓度Mcl-1基因SiRNA囊泡的HepG2细胞生存率比较

本研究采用乙醇注入法制备囊泡，与siRNA静电复合后得siRNA囊泡用于siRNA的胞内递送。文献报道肿瘤部位毛细血管通透性增加，导致大分子类物质可自由进入细胞间隙，同时淋巴回流的缺失进一步加剧了物质的聚集，此现象为增强渗透滞留(EPR)效应，一般粒径为50～200 nm的载体可通过EPR效应蓄积于实体瘤组织中[12]。本研究所制备的空白囊泡成功结合siRNA后表面形成水化层，导致其粒径显著增加，但仍旧小于200 nm，有望借助被动靶向作用进入肿瘤部位。由于细胞表面一般带负电，因此同样荷负电的游离siRNA很难在不借助载体的情况下进入细胞中，细胞摄取实验证明所制备囊泡可以很好地将siRNA递送至肿瘤细胞内。经内吞入胞的载体需有效释放siRNA才能发挥其基因沉默作用，体外释放实验结果发现包载FAM-SiRNA囊泡在释放96 h时最终释放量为67.2%±2.9%[10]。本研究结果进一步表明，Mcl-1基因siRNA囊泡可将Mcl-1基因siRNA运送至HepG2细胞内并抑制Mcl-1蛋白表达，最终抑制细胞生存。本研究结果显示，当转染浓度为100 nmol/L时，丙、丁组细胞生存率均高于甲、乙组，差异有统计学意义，丁组细胞生存率高于丙组。表明Mcl-1基因siRNA囊泡可以显著抑制人肝癌HepG2细胞存活，原因是Mcl-1基因siRNA囊泡进入细胞后释放的Mcl-1 siRNA可抑制Mcl-1蛋白表达，恢复细胞正常凋亡通路。综上所述，成功制备Mcl-1基因siRNA囊泡。HepG2细胞中Mcl-1蛋白低表达。转染Mcl-1基因siRNA囊泡的人肝癌HepG2细胞存在生长抑制。

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Preparation of Mcl-1 siRNA niosomes and its inhibitory effect on human hepatoma carcinoma HepG2 cells

WANGShaojun1,GUOSitong,WUChuang,ZHAOGan

(1TheMaternalandChildHealthHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530003,China)

Objective To prepare myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) small interfering RNA (siRNA) loaded niosomes and to observe its inhibitory effect on human hepatoma carcinoma HepG2 cells.Methods ①Preparation and functional identification of Mcl-1 siRNA loaded niosomes: Ethanol injection method was employed to prepare blank niosomes, which were then separately incubated with FAM-siRNA and Mcl-1 siRNA to form FAM-siRNA and Mcl-1 siRNA loaded niosomes through electrostatic interaction for 30 min. Malvern apparatus was used to determine the average particle size and zeta potential of blank niosomes and siRNA loaded niosomes. The encapsulation efficiency and in vitro release profile of siRNA were determined by centrifugal ultrafiltration-fluorescence spectrophotometry method. HepG2 cells were divided into groups A, B, C, and D for 24-hour cultivation, then groups C and D were treated with FAM-siRNA loaded niosomes and FAM-siRNA loaded Lipofectamin, respectively. Group B was exposed to equivalent free FAM-siRNA, while group A was subjected to no disposal. After 6-hour incubation, cellular uptake of FAM-siRNA in HepG2 cells was examined. ②The inhibitory effect of transfection of Mcl-1 siRNA loaded niosomes on HepG2 cells: Cells in logarithmic phase were divided into groups 1, 2, 3, 4, and 5 and were seeded at a density of 5×105per well for cultivation. At 24 h, cells in the groups 1, 2, 3, and 4 were treated with free Mcl-1 siRNA, FAM-siRNA loaded niosomes, Mcl-1 siRNA loaded niosomes, and Mcl-1 siRNA loaded Lipofectamin for 6 h, respectively. After another 72 h, Mcl-1 protein of cells in each group was detected. HepG2 cells were divided into groups a, b, c, d and the control group, and were treated as previously mentioned. The final concentration of siRNA of each group was at a gradient of 1, 10, 50, 100, and 200 nmol/L. The growth of cells was examined and cell viability was calculated. Results The particle size of blank niosomes was smaller while its zeta potential was larger as compared with FAM-siRNA loaded niosomes (allP<0.01). The encapsulation efficiency of FAM-siRNA was 82.3%±2.1%. The in vitro cumulative FAM-siRNA release rates of FAM-siRNA loaded noisomes at 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, and 96 h were 13.5%±2.8%, 26.1%±1.6%, 38.0%±2.9%, 50.6%±2.3%, 56.8%±2.9%, 59.9%±2.3%, 63.3%±2.0%, 65.0%±2.7%, 67.2%±2.9%, respectively. Compared with group B, cellular uptake of FAM-siRNA in groups C and D was better. The Mcl-1 protein expression levels of groups 1, 2, 3, 4 and 5 were 102.0±4.9, 103.8±8.3, 25.2±3.7, 29.4±6.4, and 96.1±5.8, respectively. Obviously, the level of group 3 was significantly less than that of groups 1, 2, and 5 (allP<0.01). Cell viability of groups c and d was significantly higher that that of groups a and b, meanwhile, the cell viability of group d was higher than that of group c (allP<0.01).Conclusion We successfully prepare Mcl-1 siRNA loaded niosomes and the expression of Mcl-1 protein is low expressed in HepG2 cells, and HepG2 cells are inhibited after transfection of Mcl-1 siRNA loaded niosomes.

myeloid cell leukemia-1; small interfering RNA; RNA interference; niosomes; liver carcinoma; cell viability

王绍军(1978-)，男，中级药师，主要研究方向为肿瘤基础与临床治疗研究。E-mail： sjwang2015@126.com

简介：赵赶(1961-)，男，副主任药师，主要研究方向为肿瘤基础与临床治疗研究。E-mail： slys2015@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.002

R734.2

A

1002-266X(2016)39-0005-04

2016-04-19)